Die Stoffwechsellandschaft des Darms männlicher Mäuse identifiziert verschiedene Nischen, die durch mikrobielle Aktivitäten bestimmt werden

Naturstoffwechsel (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bestimmte Nischen des Säugetierdarms werden von verschiedenen Mikrobiota besiedelt, der Beitrag der räumlichen Variation zum Darmstoffwechsel bleibt jedoch unklar. Hier präsentieren wir eine Karte des Längsmetaboloms entlang des Darms gesunder kolonisierter und keimfreier männlicher Mäuse. Mit dieser Karte zeigen wir eine allgemeine Verschiebung von Aminosäuren im Dünndarm zu organischen Säuren, Vitaminen und Nukleotiden im Dickdarm. Wir vergleichen die Stoffwechsellandschaften in kolonisierten und keimfreien Mäusen, um den Ursprung vieler Metaboliten in verschiedenen Nischen zu entschlüsseln, was uns in einigen Fällen ermöglicht, auf die zugrunde liegenden Prozesse zu schließen oder die produzierenden Arten zu identifizieren. Über den bekannten Einfluss der Ernährung auf die Stoffwechselnische des Dünndarms hinaus deuten unterschiedliche räumliche Muster auf einen spezifischen mikrobiellen Einfluss auf das Metabolom im Dünndarm hin. Daher präsentieren wir eine Karte des Darmstoffwechsels und identifizieren Metabolit-Mikroben-Assoziationen, die eine Grundlage für die Verbindung des räumlichen Vorkommens bioaktiver Verbindungen mit dem Stoffwechsel des Wirts oder des Mikroorganismus bilden.

Der Darm von Säugetieren wird von einer Vielzahl von Mikroorganismen bevölkert, die zusammenfassend als Darmmikrobiota1,2 bezeichnet werden. Die Mikrobiota trägt zur Verdauung und zur Immunfunktion bei und ihre Störung ist mit zahlreichen Krankheiten verbunden3,4. Zusätzlich zu den Verdauungsfunktionen und der Vorbeugung (oder Verursachung) von Infektionen sind Darmmikroorganismen auch eine Quelle bioaktiver Verbindungen, die den Wirt und andere Mikroorganismen beeinflussen3. Der Dünn- und Dickdarm sind physiologisch am deutlichsten ausgeprägt und werden von konservierten Taxa-Zusammensetzungen besiedelt4,5. Der Zwölffingerdarm erhält Nahrungsnährstoffe sowie Pankreas- und Gallensekrete. Regionale Unterschiede in der Gewebepermeabilität, den absorbierenden Transportproteinen, dem pH-Wert, den regulatorischen Signalen und den Immunantworten unterscheiden die jejunalen und ilealen Subregionen im Dünndarm weiter5. Community-Profiling in Tiermodellen hat unterschiedliche Mikrobiota-Zusammensetzungen in den verschiedenen Darmregionen gezeigt4,6,7. Über diese Längsunterschiede hinaus gibt es erhebliche Unterschiede in Bezug auf die Physiologie und die Zusammensetzung der Mikrobiota zwischen dem Lumeninhalt und dem Darmschleim8. Letzteres ist eine dichte Matrix, insbesondere im Dickdarm, die aus vernetzten Mucin-Glykoproteinen besteht, die die Epithelzellen der Darmwand vom Lumen und seiner Mikrobiota trennt9. Die dicke äußere Schleimschicht des Dickdarms stellt auch einen Lebensraum und eine Nährstoffquelle für Mikroorganismen dar, die auf den Abbau von Muzin spezialisiert sind8,10. Zunehmende Einblicke in die Funktionslandschaft des Verdauungstrakts werden durch Clostridien veranschaulicht, die Darmschleim besiedeln und abbauen, bestimmte Firmicutes, die im Dickdarm charakteristische kurzkettige Fettsäuren oder Aminosäurederivate produzieren, oder spezifische Vitamin-produzierende Bakterien in verschiedenen Darmstellen3 ,11,12,13,14,15.

Biogeografische Unterschiede in der taxonomischen Zusammensetzung und Stoffwechselaktivität können anhand von Stuhlproben nicht beurteilt werden, da sie die Erklärungskraft wahrscheinlich in gewissen Grenzen auf den distalen Dickdarm beschränken4,16. Dies gilt insbesondere für den Dünndarm, wo Nahrungszufuhr, schnelle Übergangszeiten und die Sekretion von Verdauungsenzymen und antimikrobiellen Mitteln die Darmprozesse dominieren und das Mikrobiom prägen6,17,18. Auf dem Weg zur Kausalität können detaillierte Informationen über Bakterienpopulationen und ihre Stoffwechselprozesse in verschiedenen Darmunterregionen dabei helfen, den Ursprung von Metaboliten zu ermitteln. Der Großteil der Nahrungsbestandteile wird im Dünndarm verstoffwechselt und absorbiert, sodass Ballaststoffe und Xenobiotika sowie ein kleiner Teil der aufgenommenen Proteine und Lipide für die proximale Mikrobiota des Dickdarms verfügbar bleiben17. Daher ist ein Großteil der mikrobiellen Aktivität in Stuhlproben nicht erkennbar, darunter viele der bioaktiven Verbindungen mikrobiellen Ursprungs, die auch im Dünndarm vorhanden sind19. Die Analyse der mikrobiellen Aktivität im Dünndarm des Menschen erfordert einen chirurgischen Eingriff, eine sehr umfangreiche perorale Intubation oder eine Spülung vor der Endoskopie. Daher werden Tiermodelle verwendet, um den Darm in seiner Gesamtheit zu untersuchen20,21. Ein aktuelles Beispiel berichtete über Metabolitenkonzentrationen entlang der Darmlänge kolonisierter Mäuse und entdeckte neue aus Mikrobiota stammende Gallensäurekonjugate, die die Chemie aller Organe beeinflussen und einen kausalen Zusammenhang zwischen Mikroorganismen und ihrer Wirkung auf den Wirt herstellen7. Angesichts der großen Anzahl verschiedener Mikroorganismen in den verschiedenen Darmnischen und ihrer vielfältigen Stoffwechselaktivitäten sind diese neu entdeckten Gallensäuren nur ein Beispiel für den enormen Raum der auf Metaboliten basierenden Wirt-Mikroben- und Mikroben-Mikroben-Wechselwirkungen, die darauf warten, entschlüsselt zu werden.

Hier charakterisieren wir den lokalen Darmstoffwechsel und die Gemeinschaftszusammensetzung in Lumeninhalt und Schleim von 15 Stellen entlang des Darms gesunder männlicher spezifischer pathogenfreier (SPF) und keimfreier Mäuse. Neben der Charakterisierung der vier wichtigsten Darmlebensräume von Lumeninhalt und Schleim im Dünn- und Dickdarm deckte diese Stoffwechsellandschaft bisher unbeachtete Stoffwechselprozesse im Dünndarm auf. Darüber hinaus haben wir 35 Darmverbindungen als von Mikroorganismen stammende Metaboliten identifiziert, die eine Grundlage für Studien zum nischenspezifischen Darmstoffwechsel darstellen.

Um die Metabolomzusammensetzung entlang des Darmtrakts systematisch aufzuzeichnen, haben wir den gesamten Darm von fünf männlichen SPF C57BL/6J-Mäusen an 15 diskreten Stellen untersucht (Extended Data Abb. 1a) und den Lumeninhalt vom Darmschleim getrennt. Um die biologische Variabilität zu minimieren, erhielten 10–14 Wochen alte Mäuse eine Standard-Labordiät nach Belieben und ließen vor der Probenahme 4 Stunden lang fasten, sodass die Nahrungsmenge den Blinddarm erreichte21. Jede Metabolomprobe enthielt intrazelluläre mikrobielle Metaboliten sowie extrazelluläre Metaboliten, die aus der Nahrung, Maus oder mikrobieller Aktivität stammten, und war daher eine komplexe Mischung chemischer Verbindungsklassen bei hohen Salzkonzentrationen. Um diese darmrelevanten Verbindungen zu quantifizieren, haben wir einen Flüssigchromatographie-Flugzeit-Massenspektrometrie-Workflow (LC-TOF-MS) eingeführt22. Kurz gesagt, wir haben die Laufzeit der Methode optimiert und eine Mischung aus analytischen Standards etabliert, um 138 Metaboliten zu quantifizieren, die für das Darmmetabolom charakteristisch sind, darunter Verbindungen im Aminosäure- und Nukleotidstoffwechsel, Zucker und andere Kohlenstoffquellen, Gallensäuren und Fermentationsprodukte (Erweiterte Daten). Abb. 1b und Ergänzungstabelle 1). Von diesen 138 Metaboliten konnten 128 anhand von Qualitätskontrollparametern zuverlässig quantifiziert werden (Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungsdaten). Die durchschnittliche Konzentration dieser Metaboliten im SPF-Darmlumen betrug etwa 290 nmol mg-1 Probe im Dünndarm und 1,5 µmol mg-1 im Dickdarm.

Die ortsaufgelöste Analyse des SPF-Luminalgehalts und des Schleims ermöglichte es uns, die heterogene Stoffwechsellandschaft des Mäusedarms zu charakterisieren. Metabolitenprofile über 15 Standorte wurden nach Inhalten hierarchisch gruppiert (Abb. 1a), und um den Vergleich zu erleichtern, wurden Schleimprofile nach Inhaltsclustern sortiert (Erweiterte Daten, Abb. 1c). Gallensäuren, Aminosäuren und ihre Derivate waren an allen Stellen nachweisbar, wiesen jedoch unterschiedliche räumliche Muster mit drei Hauptstellen mit maximalen Konzentrationen auf: Magen, Dünndarm und Dickdarm. Der Mageninhalt zeichnete sich durch hohe Konzentrationen hauptsächlich von Aminosäuren aus (Abb. 1a). Proteinogene Aminosäuren und ihre Derivate wurden fast ausschließlich im Dünndarm gefunden. Im Dickdarmcluster dominierten organische Säuren, Vitamine und Verbindungen im Nukleotidstoffwechsel. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) trennte den Dünn- und Dickdarm, hauptsächlich gesteuert durch Aminosäuren und ihre Derivate entlang der ersten Hauptkomponente, und bestätigte die globalen Unterschiede zwischen den beiden Regionen (Abb. 1b). Im Dickdarm trennte die zweite Hauptkomponente die Metabolomprofile des Lumeninhalts weiter vom Schleim. Insgesamt waren die Metabolitenkonzentrationen im Lumeninhalt im Durchschnitt 1,7-fach höher als im Schleim, wobei Gallensäuren, Kohlenstoffquellen, Aminosäurederivate und organische Säuren die Treiber der Trennung waren (Abb. 1c und Ergänzungstabelle 2). Nur Spermidin, Kreatin und Malat waren im Schleim signifikant häufiger anzutreffen als in Lumenproben (P ≤ 0,05, fache Änderung ≥3). Hohe Spermidinkonzentrationen waren vermutlich eine Folge der mikrobiellen Polyaminproduktion, die für die Aufrechterhaltung einer gesunden Schleimschicht, insbesondere im Dickdarm, wichtig ist23 (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 1d). Entsprechend den höheren Polyaminkonzentrationen waren die Konzentrationen der Polyaminvorläufer Arginin und Ornithin im Dickdarmschleim niedriger als im Lumengehalt (Erweiterte Daten, Abb. 1d und Ergänzungstabelle 2).

a, Hierarchische Clusteranalyse der Metabolitenhäufigkeiten aus Lumeninhaltsproben männlicher SPF-Mäuse. Die Häufigkeiten für alle 128 quantifizierten Metaboliten werden als Z-Score-normalisierte Konzentrationen angezeigt, gemittelt von fünf Mäusen an den 15 Probenahmestellen. Durch Clustering basierend auf der euklidischen Distanz wurden drei Hauptcluster identifiziert, die den drei wichtigsten physiologischen Regionen des Verdauungstrakts entsprechen: Magen, Dünndarm und Dickdarm. Metaboliten sind nach MetaCyc farblich gekennzeichnet (unten rechts). b, PCA der Metabolitenkonzentrationen einzelner männlicher SPF-Mäuse basierend auf allen 150 Lumen- und Schleimproben, die den gesamten Darm abdecken. PCA wurde an Z-Score-normalisierten Metabolitenkonzentrationen mit fünf Mäusen pro Probe durchgeführt. Farben zeigen Stellen an, die nach Darmregion gruppiert sind, Symbole zeigen Lumen oder Schleim an und die Gruppe des Dickdarminhalts ist grau hervorgehoben. c, Differentialanalyse der Metabolitenkonzentrationen zwischen Lumeninhalt und Schleimproben. Die Konzentrationen wurden über alle 15 Probenahmestellen für fünf männliche Mäuse im jeweiligen Lebensraum gemittelt. Positive oder negative Faltenveränderungen weisen auf höhere Konzentrationen im Lumen bzw. im Schleim hin. Die P-Werte wurden unter Verwendung eines zweiseitigen Student-t-Tests mit gepaarten Stichproben und Benjamini-Hochberg-Korrektur für Mehrfachtests berechnet und werden als −log10-transformiert angezeigt. Metaboliten mit deutlich unterschiedlichen Konzentrationen (absoluter log2 (fache Änderung) ≥ 1,5, korrigiertes P ≤ 0,05) werden gemäß der MetaCyc-Klassifizierung gefärbt, wie im Kasten unten definiert. Die Arten der Lumen- und Schleimprobenentnahme sind auf der linken Seite schematisch dargestellt und auf die entsprechenden Teile des Vulkandiagramms ausgerichtet. Abkürzungen: FC, Fold Change.

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Um spezifische Metaboliten zu identifizieren, die den Dünndarm vom Dickdarm unterscheiden, haben wir Faltungsänderungen aus den mittleren Metabolitenkonzentrationen im Dünn- und Dickdarm berechnet, getrennt für Lumeninhalt und Schleim, über Probenahmestellen und Einzelpersonen hinweg. Diese Differenzialanalyse ergab hohe Konzentrationen an Aminosäuren und verwandten Metaboliten im Dünndarm, insbesondere im Schleim (Abb. 2a, b und Ergänzungstabelle 3). Angesichts der eher dünnen Schleimschicht im Dünndarm können wir nicht ausschließen, dass die höheren proteinogenen Aminosäurekonzentrationen zumindest teilweise durch eine Verschleppung aus dem Lumen während der Probenentnahme verursacht werden. Repräsentative Beispiele waren Histidin und Tryptophan, deren Konzentrationen im gesamten Dünndarm konstant höher waren und im Dickdarm sofort abfielen (Abb. 2c). Der Dickdarm war durch höhere Konzentrationen an organischen Säuren, Vitaminen und Verbindungen im Aminosäure- und Nukleotidstoffwechsel gekennzeichnet (Abb. 2a, b). Insgesamt wiesen 31 Metaboliten mindestens viermal höhere Konzentrationen im Lumeninhalt oder Schleim des Dickdarms auf, der im Vergleich zum Dünndarm eine höhere Bakterienlast aufweist (Ergänzungstabelle 3), was auf mikrobielle Aktivität hinweist. Der starke Anstieg kurzkettiger Fettsäuren wie Butyrat/Isobutyrat, Zuckerabbauprodukten wie Glycerat und Aminosäureabbauprodukten wie 4-Hydroxyphenylacetat deutete auf eine umfassende mikrobielle Fermentation hin (Abb. 2d). Auch wenn PCA keine Regionen innerhalb des Darmschleims unterschied (Abb. 1b), ergab die Differentialanalyse eine deutliche metabolische Verschiebung von Aminosäuren zu Fermentationsprodukten im Schleim (Abb. 2a (unten), Abb. 2b (rechts) und Abb. 2c). ), was Hinweise auf metabolische Unterschiede zwischen den Schleimlebensräumen des Dünndarms und des Dickdarms liefert.

a, Differentialanalyse der Metabolitenkonzentrationen zwischen Dünn- und Dickdarmproben im Lumen (oben) und im Schleim (unten). Die Datenpunkte stellen mittlere Faltungsänderungswerte dar, die zwischen zehn Dünndarm- und vier Dickdarmstellen für fünf männliche Mäuse berechnet wurden. Negative und positive Werte stehen für höhere Konzentrationen im Dünn- bzw. Dickdarm. Auf der Y-Achse werden −log10-transformierte P-Werte angezeigt, die mithilfe eines zweiseitigen Student-T-Tests mit paarweiser Stichprobe und Benjamini-Hochberg-Korrektur für Mehrfachtests berechnet wurden. Metaboliten mit deutlich unterschiedlichen Konzentrationen (absolute log2(fache Änderung) ≥ 2, korrigiertes P ≤ 0,05) werden gemäß der MetaCyc-Klassifizierung farblich gekennzeichnet, wie im Kasten (unten links) definiert. b, Signifikant sich verändernde Metaboliten zwischen Dünn- und Dickdarm im Lumen und Schleim aus der Differenzialanalyse in Abb. 1a (absoluter log2 (fache Änderung) ≥ 2, korrigiertes P ≤ 0,05). Die P-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen Student-t-Tests mit gepaarten Stichproben und Benjamini-Hochberg-Korrektur für Mehrfachtests berechnet. Die Punktfarben kennzeichnen die Faltungsänderung und die Punktgröße gibt die Bedeutung an. Metaboliten werden nach MetaCyc klassifiziert, wie im Kasten (unten links) definiert. c,d, Räumliche Profile von Histidin und Tryptophan (c) und Glycerat und 4-Hydroxyphenylacetat (d) über 15 Darmstellen im SPF-Schleim bzw. -Lumen. Linien mit schattierten Bereichen zeigen den gleitenden Durchschnitt des Mittelwerts ± Standardabweichung der Konzentrationsmessungen von fünf männlichen Mäusen. Abkürzungen: cec, caecum; col, Doppelpunkt; Duo, Zwölffingerdarm; Ile, Ileum; jej, Jejunum; sto, Magen; TMAO, Trimethylamin-N-oxid.

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Das Gesamtmuster des Metaboloms ermöglichte es uns nicht, einzelne Stellen im Dünn- oder Dickdarm zu unterscheiden, da die Unterschiede zwischen einzelnen Mäusen an diesen Stellen erwartungsgemäß genauso groß waren (Abb. 1b), aber etwa ein Drittel der Metaboliten wiesen unterschiedliche Längsschnitte auf Profile (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 4). Die hierarchische Häufung der Metabolitenkonzentrationen im Dünndarm führte zu drei Gruppen: Metaboliten mit einer maximalen Konzentration im Zwölffingerdarm, Jejunum oder Ileum (Extended Data Abb. 2). Obwohl die drei Klassen in den Lumenproben gleichmäßig verteilt waren, nahmen die meisten Schleimkonzentrationen in den Dünndarmproben zum Ileum hin ab (Erweiterte Daten, Abb. 2b, c). Zu den Metaboliten mit hohen Konzentrationen im Zwölffingerdarminhalt gehörten Fructose (Abb. 3a) und andere Monosaccharide, vermutlich restliche Nahrungsbestandteile, die vom Wirt absorbiert wurden, bevor sie den distalen Dünndarm erreichten14,25. Die Riboflavinkonzentrationen waren im Jejunum am höchsten und stammten entweder aus der mikrobiellen Produktion oder aus Restvitaminen aus der Nahrung14,15,26. Hohe Allantoinkonzentrationen im Ileuminhalt (Abb. 3a) resultierten wahrscheinlich aus dem mikrobiellen Abbau von Purinmetaboliten im oberen Dünndarm koprophagischer Mäuse27, was mit hohen Konzentrationen von Guanin und Guanosin im Zwölffingerdarmschleim (Abb. 3b) und dem starken Guaninzustrom vereinbar ist und Guanosin durch die Chow-Diät. Hohe Kreatinkonzentrationen im Jejunalschleim können auf Kreatin aus der Nahrung zurückzuführen sein, wohingegen der Konzentrationsabfall wahrscheinlich auf die Aufnahme durch Darmzellen mit hohem Energiebedarf zurückzuführen ist, die verschiedene Kreatintransporter und Kreatin-metabolisierende Enzyme exprimieren28. Im Dickdarm ergab die hierarchische Häufung maximale Konzentrationen des Lumeninhalts hauptsächlich im distalen Dickdarm, wohingegen die Spitzenkonzentrationen des Schleims gleichmäßiger im gesamten Dickdarm verteilt waren (Erweiterte Daten, Abb. 3). Beim Lumengehalt waren die Uracil-Konzentrationen im distalen Dickdarm am höchsten, wohingegen Butyrat/Isobutyrat zum distalen Dickdarm hin leicht abzunehmen schien (Abb. 3c), wo Butyrat die Hauptenergiequelle der Kolonozyten ist29. Im Dickdarmschleim erreichte das Fruktose-Abbauprodukt Glycerat25 im Blinddarm seinen Höhepunkt, im Dickdarm fiel es jedoch stark ab. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass die mikrobielle Aktivität ein möglicher Faktor ist, der zu den longitudinalen Konzentrationsprofilen von 42 Dünndarmmetaboliten beiträgt.

a–c, Beispielprofile von Metaboliten mit unterschiedlicher Konzentration im Dünndarminhalt (a) und Schleim (b) oder im Lumeninhalt oder Schleim des Dickdarms (c). Linien mit schattierten Bereichen zeigen den gleitenden Durchschnitt des Mittelwerts ± Standardabweichung der Konzentrationsmessungen von fünf männlichen Mäusen. Signifikant unterschiedliche Metabolitenkonzentrationen einer Region im Dünndarm im Vergleich zur benachbarten Region sind durch Sternchen gekennzeichnet (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001). Konzentration des Fruktose-Darminhalts im Zwölffingerdarm versus Jejunum: P = 0,0245; Konzentrationen des Riboflavin-Darminhalts im Jejunum versus Ileum: P = 0,0432; Konzentrationen des Allantoin-Darminhalts im Jejunum versus Ileum: P = 0,0220; Guaninschleimkonzentrationen im Zwölffingerdarm versus Jejunum: P = 0,0005; Guanosin-Schleimkonzentrationen im Zwölffingerdarm versus Jejunum: P = 0,0129; Kreatinschleimkonzentrationen im Jejunum versus Ileum: P = 0,0278. Die P-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen Student-T-Tests mit gepaarten Stichproben berechnet. Abkürzungen: sto, Magen; Duo, Zwölffingerdarm; jej, Jejunum; Ile, Ileum; cec, Blinddarm; und col, Doppelpunkt.

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Diese Karte des Darmstoffwechsels bei SPF-Mäusen hebt den Lumeninhalt und den Schleim des Dünn- und Dickdarms als Hauptnischen mit einem weitgehend konsistenten Metabolommuster über mehrere Probenahmestellen hinweg hervor. Die allgemeine Verschiebung von höheren Konzentrationen an Aminosäuren und ihren Derivaten im Dünndarm zu Vitaminen und Fermentationsprodukten im Dickdarm wird vermutlich durch eine größere mikrobielle Aktivität im Dickdarm verursacht, was auf einen mikrobiellen Ursprung für 31 Metaboliten hinweist. Darüber hinaus haben wir für 42 der 128 gemessenen Metaboliten wesentliche Muster im Dünndarm quantifiziert. Da diese Stoffwechselunterschiede zumindest teilweise auf die mikrobielle Aktivität in verschiedenen Regionen des Darms zurückzuführen sein könnten, untersuchten wir als nächstes die Rolle der Mikrobiota.

Hohe Metabolitenkonzentrationen im Dickdarm (Abb. 2a), der für seine umfangreiche mikrobielle Aktivität bekannt ist13, 14, 29, und das räumliche Metabolitenmuster im Dünndarm (Abb. 3) lieferten nur indirekte Hinweise auf einen mikrobiellen Ursprung. Diese Metaboliten stammen nicht nur von Mikroorganismen, sondern könnten auch Metaboliten des Wirts sein, die als Reaktion auf Mikroorganismen, restliche Nahrungsbestandteile oder intrazelluläre Metaboliten aus ausgeschiedenen Darmzellen entstehen. Um einen direkteren Beweis für den mikrobiellen Einfluss auf den Darmstoffwechsel zu erhalten und Längsveränderungen in den betroffenen Metaboliten zu analysieren, führten wir ein Matching-Experiment mit fünf männlichen keimfreien C57BL/6J-Mäusen durch, deren Darminhalt und Schleim anschließend an denselben 15 Stellen entnommen wurden Fasten. Im Allgemeinen wiesen mindestens zwei Drittel der Metaboliten in Gegenwart von Bakterien höhere Konzentrationen auf; Fast 50 % des Lumengehalts und 30 % der Schleimmetaboliten wiesen bei SPF-Mäusen mindestens zweifach höhere Konzentrationen auf als bei keimfreien Mäusen (Erweiterte Daten, Abb. 4a und Ergänzungstabellen 5 und 6). Zu den Metaboliten mit besonders hohen Konzentrationen bei SPF-Mäusen gehörten Gallensäuren, organische Säuren, aromatische Verbindungen, Vitamine und Aminosäurederivate (Ergänzungstabellen 5 und 6). Nur etwa ein Viertel der Metaboliten waren in keimfreien Mäusen häufiger anzutreffen, hauptsächlich Kohlenstoffquellen und Verbindungen des Nukleotid- und Aminosäurestoffwechsels, die möglicherweise ernährungsbedingten Ursprungs sind und bei SPF-Mäusen durch die Mikrobiota dezimiert werden30.

Von den oben genannten 31 Metaboliten potenziellen mikrobiellen Ursprungs wiesen 24 im Dickdarm von SPF-Mäusen mindestens viermal höhere mittlere Konzentrationen auf als keimfreie Mäuse (Abb. 4a und Ergänzungstabelle 7). Die kurzkettigen Fettsäuren Butyrat/Isobutyrat und Isovalerat/Valerat sowie die sekundären Gallensäuren Lithocholat und Hyodesoxycholat wiesen im Dickdarm von SPF-Mäusen mindestens 14-fach höhere Konzentrationen auf. Solch hohe Konzentrationen stehen im Einklang mit ihrer bekannten Bildung durch die reichlich vorhandenen Bacteroidales, die niedrigen Sauerstoffgehalt und niedrigen pH-Wert tolerieren, im Dickdarm4,31. Biotin, Indol-3-propionat und Glycerin wurden ausschließlich bei SPF-Mäusen nachgewiesen, was einen starken Beweis für ihren mikrobiellen Ursprung liefert. Indol-3-propionat ist eine gut etablierte Verbindung, die aus der Darmflora stammt und aus dem Tryptophan-Metabolismus resultiert13,32. Für die meisten der 31 Metaboliten des Dickdarms stimmte unsere Hypothese des mikrobiellen Ursprungs entweder mit gezielten Studien überein oder beobachtete zuvor höhere Werte bei kolonisierten Mäusen als bei keimfreien Mäusen 3,19,30,32,33 (Abb. 4a und Ergänzungstabelle 7). ). Die höhere SPF-Konzentration des allgegenwärtigen intrazellulären Metaboliten 2-Oxoglutarat (Abb. 4b) ist höchstwahrscheinlich auf die hohe Bakterienlast zurückzuführen, wie zuvor beschrieben34. Neu identifizierte Metaboliten mikrobiellen Ursprungs waren Hydrocinnamat, 3-Hydroxybutyrat, Caproat, Adenosin und Fucose/Rhamnose (Abb. 4c und Extended Data Abb. 4b). Ähnlich wie Phenylacetat und 4-Hydroxyphenylacetat kann Hydrocinnamat aus der Fermentation aromatischer Aminosäuren entstehen, wie in vitro für mehrere Darmmikroorganismen gezeigt wurde35. Ebenso sind 3-Hydroxybutyrat und Caproat Fermentationsprodukte36. Zucker wie Fucose/Rhamnose werden höchstwahrscheinlich durch sezernierte mikrobielle Glykosidhydrolasen aus Ballaststoffen freigesetzt. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen19, 30 deuten die höheren Konzentrationen von Kreatin und Guanosin im Dickdarm bei keimfreien Mäusen auf einen Wirts- oder Ernährungsursprung hin (Abb. 4a). Insgesamt liefern höhere Metabolitenkonzentrationen bei SPF-Mäusen als bei keimfreien Mäusen somit Belege für den mikrobiellen Ursprung oder die durch Mikrobiota induzierte Wirtsproduktion von 24 der 31 Metaboliten mit hohen Dickdarmkonzentrationen.

a, Häufigkeitsfaltenänderungen von 31 Metaboliten mit höheren Konzentrationen im Dickdarm als im Dünndarm, daher wird angenommen, dass sie mikrobiellen Ursprungs sind (signifikante Veränderung der Metaboliten aus der Differenzialanalyse; Abb. 2a, b). Die log2-transformierten Faltungsänderungen für Lumeninhalt (links) und Schleim (rechts) wurden aus gemittelten Konzentrationen für die vier großen Darmprobenentnahmestellen von fünf männlichen SPF-Mäusen im Vergleich zu fünf männlichen keimfreien Mäusen berechnet. Boxplots basieren daher auf 20 Datenpunkten, der Median log2 (Fold Change) wird in Rot angezeigt, Boxen enthalten das 25. bis 75. Perzentil und die Whiskers erstrecken sich bis zu den extremsten Datenpunkten, die nicht als Ausreißer gelten. Der graue Bereich markiert den absoluten log2 (fache Änderung) ≤ 2. Die Symbole auf der linken Seite zeigen frühere Beweise an: () Allgemeinwissen über bestimmte Metaboliten, siehe beispielsweise Koh et al. und de Aguiar Vallim et al.29,66; (Δ) Beweise von Han et al.19, die den Vergleich von keimfreien Swiss-Webster-Mäusen mit herkömmlichen Mäusen nutzen, um unterschiedliche Metabolitenhäufigkeiten zu identifizieren; (□) Belege von Matsumoto et al.33 unter Verwendung keimfreier und „ehemaliger keimfreier“ Mäuse, denen Stuhlsuspension von SPF BALB/c-Mäusen in den Magen geimpft wurde, um Metaboliten als von Mäusen oder Mikroorganismen stammend zu klassifizieren; () Beweise von Marcobal et al.30, die keimfreie und konventionelle Swiss-Webster-Mäuse verwendeten, um die Metabolitenspiegel zu vergleichen; () Beweise von Sridharan et al.32, die Reaktionsnetzwerkmodelle verwenden, um mikrobiotaabhängige Stoffwechselprodukte vorherzusagen. Alle verwendeten Daten aus veröffentlichten Arbeiten einschließlich Erläuterungen finden Sie in der Ergänzungstabelle 7. Darüber hinaus bezeichnet (◯) Metaboliten, die ausschließlich bei männlichen SPF-Mäusen nachgewiesen wurden. Für die SPF-exklusiven Metaboliten können Fold Changes nicht berechnet werden, wie durch ∞ angegeben. b,c, Dickdarmkonzentration von 2-Oxoglutarat (b) und Hydrocinnamat (c) in SPF und keimfreier Lumeninhalt und Schleim. Die durchgezogenen Balken zeigen die mittlere Konzentration der Messungen von fünf männlichen Mäusen, gemittelt über die vier Dickdarmstellen. Die 20 entsprechenden Datenpunkte werden als Kreise angezeigt. Abkürzungen: FC, Fold Change; cont, Lichtinhalt; GF, keimfrei; Schleim, Schleim.

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Um ernährungsbedingte Beiträge zu erhöhten Metabolitenkonzentrationen auszuschließen, haben wir die Zusammensetzung von Futterpellets mithilfe der ungezielten Fließinjektionsanalyse-Flugzeit-Massenspektrometrie (FIA-TOF-MS) bestimmt37. Kurz gesagt, wir lösten und extrahierten drei Nahrungspellets gemäß dem für Darmproben verwendeten Protokoll. Basierend auf genauen Massen- und Isotopenmustern haben wir mutmaßlich 1.379 Metaboliten-Ionen mit Anmerkungen versehen. Trotz unterschiedlicher Ionisierungseffizienzen ermöglichten uns die gemessenen Intensitäten eine grobe Schätzung der relativen Häufigkeit der nachgewiesenen Verbindungen. Die Verteilung der scheinbaren Häufigkeiten war bemerkenswert verzerrt. Siebzehn Metaboliten machten 50 % des in Pellets aufgezeichneten Gesamtsignals aus (Ergänzungstabelle 9), wobei Disaccharide den Hauptbeitrag leisteten (durchschnittlich 14 %). Weitere häufig vorkommende Metaboliten waren Adenin, Malat, Hexosen, Lysin, Guanosin, Guanin und Tryptophan. Hohe Nahrungskonzentrationen der Purinnukleotide Guanosin und Guanin erklären deren Häufigkeit bei keimfreien Mäusen und niedrige Konzentrationen im SPF-Darm, wo wir einen gleichzeitigen Anstieg des Purinabbauprodukts Allantoin beobachteten. Am wichtigsten ist, dass keiner der 24 Metaboliten, die unserer Meinung nach mit der Mikrobiota in Verbindung stehen, mehr als 0,05 % zur Zusammensetzung der Nahrung beitrug. Daher scheint die Häufigkeit dieser Marker in der Ernährung eine untergeordnete Rolle zu spielen.

Schließlich suchten wir nach Hinweisen auf einen mikrobiellen Ursprung unter den 42 Metaboliten mit einem Längsmuster im Dünndarm von SPF-Mäusen. Mit Ausnahme von Phenyllactat erfüllte keiner von ihnen unser Kriterium einer vierfach höheren Konzentration bei SPF-Mäusen im Vergleich zu keimfreien Mäusen bei der Mittelung aller zehn Probenahmestellen (Extended Data Abb. 5a). An bestimmten Stellen im Dünndarm erreichten jedoch acht Lumeninhalte und zwei Schleimmetaboliten bei SPF-Mäusen viermal höhere Konzentrationen als bei keimfreien Mäusen, wenn man Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum getrennt betrachtet (Abb. 5a und erweiterte Daten Abb. 5b). C). Beispielsweise stiegen die Konzentrationen des Purinstoffwechsel-Endprodukts Allantoin im gesamten Dünndarm von SPF-Mäusen an und erreichten im Ileum ein Maximum, während die Konzentrationen bei keimfreien Mäusen niedrig blieben (Abb. 5b). Konsequenterweise waren die Konzentrationen der Purinmetaboliten Guanin, Guanosin und Hypoxanthin in der Nahrung bei SPF-Mäusen niedriger als bei keimfreien Mäusen (Abb. 5c), was einen Beweis für deren mikrobiellen Abbau und die anschließende Umwandlung in Allantoin liefert. Ein anderes Profil wurde für Kreatin beobachtet, dessen Konzentration zunächst im Schleim sowohl von SPF-Mäusen als auch von keimfreien Mäusen anstieg, bei keimfreien Mäusen jedoch auf den Ausgangswert abfiel und im Jejunum von SPF-Mäusen ein Maximum erreichte (Abb. 5d). Der anfängliche gleichzeitige Konzentrationsanstieg war möglicherweise auf dessen Vorhandensein in der Nahrung zurückzuführen, aber das unterschiedliche Muster im Jejunum deutete entweder auf eine mikrobielle Produktion oder eine mikrobielle Veränderung des Kreatinverbrauchs durch Darmzellen hin35. Zu den anderen acht Metaboliten mit höheren Spitzenkonzentrationen bei SPF-Mäusen gehörten mehrere Verbindungen, die mit dem Aminosäure- oder Nukleotidstoffwechsel in Zusammenhang stehen. Ein Beispiel ist das aus aromatischem Indol gewonnene Indolacetylglycin, dessen Konzentration im gesamten SPF-Dünndarm schwankte, im distalen Dünndarm keimfreier Mäuse jedoch unter der Nachweisgrenze lag (Extended Data Abb. 5b), was stark auf einen mikrobiellen Einfluss schließen lässt . Die durchweg höheren Dünndarmkonzentrationen von Cytidin-5-monophosphat, Uracil und Histidin lassen sich am besten als intrazelluläre mikrobielle Metaboliten erklären. Zusätzlich zu den 24 Metaboliten im Dickdarm liefern wir damit Hinweise auf den mikrobiellen Ursprung von 11 Metaboliten im Dünndarm.

a: Heatmap-Darstellung von Metaboliten mit mindestens viermal höheren Konzentrationen bei männlichen SPF-Mäusen als bei männlichen keimfreien Mäusen, insbesondere an einer Stelle des Dünndarms im Vergleich zum gesamten Dünndarm. Die linke Spalte zeigt die gemittelten log2-transformierten Faltenveränderungen aller zehn Dünndarmstellen (SPF gegenüber keimfrei), und die nächsten drei Spalten zeigen die gemittelten Faltenveränderungen (SPF gegenüber keimfrei) im Zwölffingerdarm, Jejunum oder Ileum getrennt . Anhand räumlicher Profile (wie in Abb. 3, hier nicht alle gezeigt) haben wir die Region (Duodenum, Jejunum oder Ileum) identifiziert, die sich von der Nachbarregion unterscheidet. Für diesen mit einem Sternchen markierten Bereich vermuten wir, dass eine mikrobielle Beteiligung den deutlichen Unterschied und folglich auch einen höheren Lichtschutzfaktor gegenüber der keimfreien Konzentration verursacht. b, Räumliche Profile der Allantoinkonzentrationen im Lichtschutzfaktor und im keimfreien Lumengehalt. Linien mit einem schattierten Bereich zeigen den gleitenden Durchschnitt des Mittelwerts ± Standardabweichung der Konzentrationsmessungen von fünf männlichen Mäusen. c, Dünndarmkonzentrationen von Guanin, Guanosin und Hypoxanthin in SPF und keimfreiem Lumeninhalt und Schleim. Ausgefüllte Balken zeigen die mittlere Konzentration der Messungen von fünf männlichen Mäusen an zehn Dünndarmstellen. Die 50 entsprechenden Datenpunkte werden als Kreise angezeigt. d, Räumliche Profile der Kreatinkonzentrationen in SPF und keimfreiem Schleim. Linien mit einem schattierten Bereich zeigen den gleitenden Durchschnitt des Mittelwerts ± Standardabweichung der Konzentrationsmessungen mit fünf männlichen Mäusen. Abkürzungen: FC, Fold Change; GF, keimfrei; vs., versus; sto, Magen; Duo, Zwölffingerdarm; jej, Jejunum; Ile, Ileum; cec, Blinddarm; col, Doppelpunkt; cont – Lichtinhalt; muc – Schleim; NaN, keine Zahl (Faltungsänderungen konnten nicht berechnet werden).

Quelldaten

Um zu untersuchen, ob die Metabolommuster mit der Zusammensetzung des Mikrobioms zusammenhängen, haben wir mithilfe der 16S-ribosomalen RNA-Sequenzierung des Zwölffingerdarms, des Jejunums, des Ileums, des Blinddarms und des Dickdarms von fünf zusammen gehaltenen männlichen SPF-Mäusen aus demselben Wurf ein Profil des Lumeninhalts und der Zusammensetzung der Schleimgemeinschaft erstellt. An allen fünf Standorten wurde die Gemeinschaft auf Stammebene von Firmicutes und auf Familienebene von Lachnospiraceae, Oscillospiraceae, Lactobacillaceae und Bacteroidaceae dominiert (Extended Data Abb. 6a). Wie erwartet7, nahm die relative Häufigkeit von Bacteroidales im Dickdarm zu, insbesondere in Lumenproben, was mit hohen Konzentrationen an kurzkettigen Fettsäuren und sekundären Gallensäuren einherging. In Übereinstimmung mit den Metabolommustern war die Zusammensetzung der Gemeinschaft über die drei Dünndarmstellen hinweg weitgehend unveränderlich. Die Hauptunterschiede zwischen Lumengehalt und Schleim in Bezug auf die Zusammensetzung waren eine allgemein größere Diversität und die relative Häufigkeit von Akkermansiaceae im Lumengehalt (Extended Data Abb. 6a). Diese Unterschiede waren im Jejunum am ausgeprägtesten, wo bis zu 20 % der gesamten Inhaltsgemeinschaft Akkermansiaceae waren.

Um den Beitrag von Mikroorganismen zum gemessenen Darmmetabolom zu bewerten, haben wir das Funktionspotenzial des Mikrobioms mithilfe des PICRUSt2-Tools38 bestimmt, das den Enzympool jedes erkannten Mikroorganismus vorhersagt. Durch den Vergleich des erhaltenen Satzes aller potenziellen mikrobiellen Reaktionen mit dem bekannten Satz metabolischer Reaktionen bei Mäusen aus der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Datenbank wurden Metaboliten als potenziell mit dem Wirt (7), dem Mikrobiom (13) verknüpft klassifiziert. oder beides (81) (Abb. 6a). Beispielsweise lassen sich die hohen Konzentrationen von Spermin und Hydrocinnamat in SPF-Mäusen am besten durch den Ursprung im Wirt bzw. im Mikrobiom erklären. Um die produzierenden Arten zu identifizieren, korrelierten wir die Häufigkeit von Metaboliten und Mikroorganismen räumlich entlang des SPF-Darms. Insgesamt zeigten die Korrelationskoeffizienten eine Normalverteilung, wobei 620 Metabolit-Mikroben-Paare ein signifikantes gleichzeitiges Auftreten zeigten (P <0, 01) (Abb. 6b). Um die Vorhersagen einer potenziellen mikrobiellen Produktion zu verfeinern, haben wir nur Metaboliten berücksichtigt, die in SPF-Mäusen häufiger vorkommen als in keimfreien Mäusen (Fachänderung > 2). Basierend auf den oben vorhergesagten mikrobiellen Stoffwechselreaktionen haben wir unsere Analyse weiter auf Paare beschränkt, in denen die vorhergesagten Mikroorganismen über Enzyme verfügen, die Reaktionen katalysieren, an denen der gepaarte Metabolit beteiligt ist. Insgesamt haben wir aus der Korrelation von 20 Metaboliten mit der Häufigkeit von 91 Mikroorganismen, die 14 verschiedene Bakterienordnungen umfassen, 148 Paare potenzieller mikrobieller Metabolitenproduktion vorhergesagt (Abb. 6c und Ergänzungstabelle 10). Wie aufgrund ihrer allgegenwärtigen Natur zu erwarten war, wurden Stoffwechselzwischenprodukte wie n-Acetylglutamat und das Fructose-Abbauprodukt Glycerat mit 41 bzw. 22 Mikroorganismen in Verbindung gebracht. Zehn Metaboliten waren spezifischer mit drei oder weniger Mikroorganismen verknüpft, darunter eine einzige Mikroorganismenverbindung für Butyrat, Chenodesoxycholat, Rhamnose und Succinat. Für Butyrat und Chenodesoxycholat, die die Metaboliten mit dem höchsten SPF im Vergleich zur keimfreien Faltungsveränderung sind, haben wir eine nicht klassifizierte Gruppe der bekannten kurzkettigen Fettsäureproduzenten Lachnospiraceae39 und Mitglieder der Gruppe Lachnospiraceae NK4A136 als verantwortliche Mikroorganismen identifiziert (Abb . 6d). Dieses und andere beobachtete räumliche Zusammentreffen von Metaboliten mit bestimmten Mikroorganismen verstärken unsere hypothetische Verbindung zur mikrobiellen Aktivität weiter.

a, Venn-Diagramm, das die Überlappung von 128 gemessenen Metaboliten zeigt, die als wirts- oder mikroorganismusbezogen klassifiziert wurden, basierend auf PICRUSt2-Vorhersagen der mikrobiellen Stoffwechselfunktionen und des Stoffwechselnetzwerks der Maus. Die Mehrzahl der Metaboliten kann weder als Wirts- noch als Mikroben-assoziiert klassifiziert werden, sieben Metaboliten sind Wirts-assoziiert und dreizehn Metaboliten sind Mikroorganismen-assoziiert. 27 Metaboliten stimmten mit keinem der Stoffwechselnetzwerke überein. b, Verteilung der Korrelationskoeffizienten von 126.336 Metabolit-Mikroben-Paaren. Vergrößerte Balken zeigen, wie die Anwendung von Schwellenwerten auf den P-Wert, die SPF-keimfreie Faltungsänderung und das Vorhandensein von Stoffwechselenzymen die Anzahl der vorhergesagten funktionellen Metabolit-Mikroben-Paare auf 148 reduziert. c, Sankey-Diagramm, das Verbindungen zwischen einzelnen Metaboliten und zeigt die entsprechenden mikrobiellen Ordnungen in positiv korrelierten Metabolit-Mikroben-Paaren, die die in b definierten Schwellenwerte erfüllen. Metaboliten sind nach MetaCyc farblich gekennzeichnet. Die Größe der Verbindungslinie gibt die Anzahl der Paare an. d, Räumliche Profile der Metabolitenkonzentrationen und assoziierter Mikroorganismen in SPF-Lumenproben. Linien mit einem schattierten Bereich geben den Mittelwert ± Standardabweichung der Konzentrationsmessungen mit fünf männlichen Mäusen und den Mittelwert ± Standardabweichung der relativen Mikroorganismenhäufigkeit an. Abkürzungen: Duo, Duodenum; jej, Jejunum; Ile, Ileum; cec, Blinddarm und Col, Dickdarm.

Quelldaten

Wir berichten über eine anatomisch aufgelöste Karte des Darmstoffwechsels bei gesunden männlichen SPF- und keimfreien Mäusen, die den Lumeninhalt und den Schleim des Dünn- und Dickdarms als vier metabolisch unterschiedliche Nischen erkennen lässt. Das Metabolom des Dünndarms wurde von Aminosäuren dominiert und der Dickdarm war durch hohe Konzentrationen an Fermentationsprodukten, Vitaminen und Verbindungen im Nukleotidstoffwechsel gekennzeichnet, was mit der viel höheren Dichte an Mikroorganismen im Dickdarm übereinstimmt4. Im Einklang mit seinen physikalisch-chemischen und immunologischen Eigenschaften8,40 war die dicht besiedelte äußere Schleimschicht, die den Darm auskleidet, auch metabolisch unterschiedlich, wobei aus Mikroorganismen stammende Polyamine und Kreatin die charakteristischsten Merkmale waren. Kreatin und Polyamine wie Spermidin spielen bekanntermaßen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Schleimschicht, insbesondere in Gegenwart einer Mikrobiota35,41,42. Übermäßig hohe Konzentrationen proteinogener Aminosäuren unterschieden die dünne Schleimschicht im Dünndarm von der dickeren Schicht im Dickdarm4, möglicherweise eine Folge der Diffusion aus dem Lumeninhalt oder des enzymvermittelten Proteinabbaus.

Zusätzlich zur Charakterisierung der vier wichtigsten Darmnischen löste unser Datensatz das räumliche Muster von 42 Metaboliten im Dünndarm auf, einem Teil des Darmtrakts, der von Natur aus schwer zugänglich ist18 und in dem Mikroorganismen viele bioaktive Verbindungen produzieren19. Hohe Konzentrationen von Fruktose und anderen Monosacchariden im Zwölffingerdarm, stromabwärts des Magens, resultierten wahrscheinlich aus dem Abbau von Nahrungsbestandteilen, die später vom Wirt aufgenommen wurden14,25,43. Gegen Ende des Dünndarms fanden wir Hinweise auf die mikrobielle Umwandlung von Purinmetaboliten, die zu hohen Allantoinkonzentrationen im Ileuminhalt führt. Ebenso deuteten hohe schwankende Konzentrationen von Indolderivaten wie Indolacetylglycin im Dünndarm von SPF-Mäusen auf einen mikrobiellen Ursprung hin, der bisher hauptsächlich im Dickdarm beschrieben wurde44. Der mikrobielle Indolstoffwechsel ist wichtig, da Indole die Freisetzung von Darmhormonen regulieren, die die Verdauung des Wirts steuern45. Indolderivate wirken auch als Agonisten über den Arylkohlenwasserstoffrezeptor, der die Integrität der Epithelbarriere reguliert und so Darmentzündungen begrenzt6,46. Unsere hochauflösenden Metabolomdaten liefern somit Einblicke in die mit Mikroorganismen verbundene Stoffwechseldynamik in Teilregionen des Dünndarms und ergänzen so etablierte Ressourcen wie Transkriptionsdaten im Tabula Sapiens-Projekt47 und andere umfassende Studien7 um funktionelle Informationen. Unsere metabolische Variabilität stimmt im Allgemeinen mit den berichteten Mikrobiomschwankungen zwischen verschiedenen Probenahmestellen innerhalb der Darmunterregionen überein, obwohl die Daten zu den funktionellen Metaboliten viel weniger zu variieren scheinen als die mikrobielle Zusammensetzung, was wahrscheinlich durch die funktionelle Redundanz des Darmmikrobioms erklärt werden kann48.

Basierend auf der höheren Konzentration bei SPF-Mäusen im Vergleich zu keimfreien Mäusen lieferten wir Hinweise auf einen mikrobiellen Ursprung für 11 bzw. 24 Metaboliten im Dünn- und Dickdarm. Darüber hinaus konnten wir durch die Vorhersage des Stoffwechselpotenzials des Mikrobioms und die Durchführung räumlicher Koexistenzanalysen spezifische Mikroorganismen als potenzielle Produzenten für 20 Metaboliten identifizieren. Obwohl die Stoffwechselnische des Dünndarms hauptsächlich durch die Ernährung und die Verdauungsaktivitäten des Wirts bestimmt wird16, haben wir gezeigt, dass die Darmmikrobiota über den Lipid- und Gallensäurestoffwechsel hinaus zur Gestaltung des Dünndarmmetaboloms beiträgt6,49. Unsere anatomisch aufgelöste Stoffwechselkarte ermöglichte es uns, auf einige der zugrunde liegenden Prozesse des Metabolitenmusters zu schließen, wie z. B. hohe Konzentrationen von Allantoin im Ileum, die offenbar aus dem mikrobiellen Abbau von Purinen resultieren und möglicherweise Stickstoff in der allgemein stickstoffarmen Umgebung des Darms liefern50 . Kontinuierlich steigende Kreatinkonzentrationen im Jejunum von SPF-Mäusen stehen im Gegensatz zu den niedrigeren Konzentrationen bei keimfreien Mäusen, was entweder auf eine mikrobielle Produktion, eine Veränderung des Kreatinverbrauchs durch Wirtsdarmzellen35,51 oder eine Stimulation der Kreatinproduktion in Leber und Niere28 schließen lässt. Zu den 24 von Mikrobiota abgeleiteten Metaboliten im Dickdarm gehören mehrere etablierte mikrobielle Produkte wie die kurzkettigen Fettsäuren Butyrat/Isobutyrat und Isovalerat/Valerat sowie die mit Mikroorganismen verbundenen sekundären Gallensäuren Lithocholat und Hyodesoxycholat31,52,53. In mehreren Studien wurde zuvor berichtet, dass unterschiedliche Untergruppen dieser Verbindungen im Kot oder Dickdarm kolonisierter Mäuse sehr häufig vorkommen3,19,30,32,33, wir haben jedoch neu Hydrocinnamat, Adenosin, 3-Hydroxybutyrat, Caproat und Fucose/Rhamnose als Verbindungen von identifiziert mikrobieller metabolischer Ursprung. Rhamnose und Adenosin könnten mit bestimmten Clostridien und Bakterien in Verbindung gebracht werden, die die für ihre Bildung notwendigen Enzyme enthalten. Gleichzeitig vorkommende Mikroorganismen sind potenzielle Produzenten der anderen drei neuartigen Verbindungen, aber solche Korrelationen können indirekt auch aus mikrobiellem Wachstum auf überkreuz gefütterten Metaboliten resultieren. Im Gegensatz dazu kann Hydrocinnamat (auch bekannt als 3-Phenylpropionat) von eukaryontischen Zellen nicht produziert werden. Somit resultiert die 259-fach höhere Konzentration im Dickdarm von SPF-Mäusen im Vergleich zu keimfreien Mäusen vermutlich aus der Umwandlung von Phenylalanin und Tyrosin durch Clostridien13, was mit Clostridienhäufigkeiten im Dickdarm zusammenfällt, die etwa die Hälfte des Gesamtvolumens ausmachen SPF-Mikrobiom4,13,29. Der Ketonkörper 3-Hydroxybutyrat ist ein Wirtsmetabolit mit primärer Produktion in der Leber, aber er ist auch ein potenzielles Produkt verschiedener Clostridien, die in unseren 16S-Daten identifiziert wurden. Seine zehnfach höhere Konzentration im Dickdarm von SPF-Mäusen könnte daher auf mikrobielle Sekretion, mikrobielle Induktion der 3-Hydroxybutyrat-Produktion durch den Wirt oder eine Kombination aus beidem zurückzuführen sein, deren Klärung weitere Experimente erfordern würde.

Nach unserem Kenntnisstand stellen wir hier die erste anatomische In-vivo-Karte des ungestörten Lumen- und Schleimstoffwechsels entlang des gesamten Mäusedarms zur Verfügung. Dabei bündeln wir auch Erkenntnisse aus früheren Studien, die diätetische Interventionen, Krankheitsmodelle oder spezifische Darmlokalisationen untersucht haben. Der Vergleich der Stoffwechsellandschaften in männlich kolonisierten SPF-Mäusen mit keimfreien Mäusen ermöglichte es uns, den Ursprung vieler Metaboliten in verschiedenen Nischen zu entschlüsseln und in einigen Fällen Rückschlüsse auf die zugrunde liegenden Prozesse zu ziehen. Diese Assoziationen werden durch eine Korrelationsanalyse weiter gestärkt, die spezifische Metabolit-Mikroben-Assoziationen ermittelt. Obwohl uns ein Vergleich mit Fäkalien fehlt, kommen wir auf der Grundlage dieser Stoffwechselunterschiede und der berichteten Unterschiede in der Mikrobiota7,16 zu dem Schluss, dass der Darm eine viel zu variable Umgebung ist, als dass er nur anhand von Kotproben angenähert werden könnte, wie für monokolonisierte Mäuse54 gezeigt wurde. Unser Datensatz bietet auch einen Ausgangspunkt für zukünftige Studien zum Darmstoffwechsel.

Alle Mausexperimente wurden in Übereinstimmung mit den eidgenössischen und kantonalen Vorschriften durchgeführt. Die Bewilligung wurde von der Tierversuchskommission des Kantons Bern erteilt. Männliche C57BL/6J-Mäuse wurden in der Clean Mouse Facility der Universität Bern, Schweiz, gezüchtet und gehalten. Männlich kolonisierte SPF-Mäuse auf einem C57BL/6J-Hintergrund wurden von Envigo gekauft. Männliche keimfreie C57BL/6J-Mäuse wurden per Kaiserschnitt gewonnen und unter aseptischer Haltung in flexiblen Folienisolatoren gehalten. Pro Gruppe wurden fünf Replikattiere verwendet. Alle Mäuse waren 10–14 Wochen alt, es wurde bestätigt, dass sie frei von Krankheitserregern waren, und sie wurden einem 14-stündigen Licht-/10-stündigen Dunkelzyklus bei einer Durchschnittstemperatur von 20 °C und 40 % Luftfeuchtigkeit ausgesetzt. Alle Mäuse erhielten die Standard-Labornahrung Kliba Nafag 3436 und Wasser nach Belieben. Mäuse wurden zur gleichen Tageszeit durch Zervixluxation getötet, um Schwankungen aufgrund des zirkadianen Rhythmus nach 4-stündigem Fasten zu kontrollieren, was den Abschluss der Passage durch den Dünndarm ermöglicht55. Die restliche Nahrung befindet sich im Blinddarm und die Nachbildung von Mäusen ist dadurch besser vergleichbar. Proben des Lumeninhalts und des Darmschleims wurden an 15 Stellen entlang des Darms gesammelt, wie zuvor beschrieben8. Kurz gesagt, der gesamte Magen-Darm-Trakt wurde über einen Bauchschnitt reseziert. Die verschiedenen Darmbereiche (Magen, Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm) wurden getrennt, in Längsrichtung geöffnet, der Lumeninhalt entfernt und der Schleim von den Darmwänden abgekratzt. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Metaboliten wurden aus 50 mg Probe in 20 Volumina pro Gewicht bei 80 °C Millipore-Wasser extrahiert. Die Proben wurden 10 s lang gevortext, 3 Minuten lang bei 80 °C in einem Eppendorf Thermomixer bei maximaler Geschwindigkeit (1.500 U/min) inkubiert, 10 s lang gevortext und 3 Minuten lang bei 20.000 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Vom Überstand wurden 150 µl in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt und bei –80 °C gelagert. Für die massenspektrometrische Analyse wurden die Proben 1:1 in mobiler Phase (Methanol/Wasser/Essigsäure 49,6:49,6:0,8 v/v/v) verdünnt, die die Retentionszeit-Referenzverbindung 9-Anthracencarbonsäure (Sigma-Aldrich) enthielt bis zur Analyse bei −20 °C gelagert. Für die Metabolitenextraktion aus Futterpellets wurden drei Pellets gewogen und über Nacht bei Raumtemperatur in 20 ml Millipore-Wasser gelöst. Am nächsten Tag wurden 10 ml Millipore-Wasser hinzugefügt und 10 s lang gevortext. Ein Milliliter Futterpelletsuspension wurde auf 80 °C erhitzt und die Metaboliten wurden wie oben beschrieben extrahiert (3 Minuten Inkubation bei 80 °C in einem Eppendorf Thermomixer bei maximaler Geschwindigkeit (1.500 U/min), 10 Sekunden lang gevortext und 3 Minuten lang zentrifugiert 20.000g bei Zimmertemperatur). Vom Überstand wurden 150 µl in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Vor den Messungen wurden die Proben 1:20 in MilliQ-Wasser verdünnt.

Methanol und Isopropanol in HPLC-Qualität, alle Chemikalien, Pufferzusätze für die Online-Massenreferenzierung und Probenvorbereitungschemikalien wurden von Sigma-Aldrich, Agilent Technologies und Cayman Chemicals bezogen. Wasser in HPLC-Qualität wurde mit einem IQ7000 MilliQ-Wasseraufbereitungssystem erhalten, das mit einem LC-Pak (Merck) ausgestattet war.

Die Proben wurden auf einem Agilent 1290 Infinity LC-System analysiert, das mit einem Agilent 6550 Accuracy Mass Q-TOF-Massenspektrometer unter Verwendung von Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization (Agilent Technologies) gekoppelt war. Das Injektionsvolumen betrug 4 µl und die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer Zorbax SB-Aq 1,8 µM 2,1 × 50 mm-Säule mit einer Zorbax SB-C8-Schutzsäule und einer Kartusche mit schneller Auflösung (2,1 × 30 mm 3,5 μm) erreicht. Die Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten mit einer Flussrate von 0,6 ml/min erreicht, beginnend mit 2 % mobiler Phase B (0,2 % v/v Essigsäure in Methanol), die sich im Laufe von 13 Minuten allmählich zu 98 % Eluent B änderte. Darauf folgt ein 1,5-minütiger isokratischer Fluss von 2 % mobiler Phase A (0,2 % v/v Essigsäure in MilliQ-Wasser) und eine 1-minütige Äquilibrierung bei 2 % Eluent B. Die Datenerfassung erfolgte mittels Elektrospray-Ionisation im Positiv und Negativmodus mit Vollscan-Analyse über einen Massenbereich von m/z 50 bis m/z 1.700 im 2-GHz-Erfassungsmodus mit erweitertem Dynamikbereich. Zur Online-Massenachsenkorrektur wurden der mobilen Phase Purin und Hexakis (1H,1H,3H-Tetrafluorpropoxy)phosphazin (HP-0921; Agilent Technologies) zugesetzt. Die Elektrospray-Einstellungen waren wie folgt: Ionenspray-Spannung, 3,5-kV-Negativmodus und 4-kV-Positivmodus; Kapillartemperatur, 325 °C; Trocknungsgasfluss, 10 l min−1; und 45 psi Verneblerdruck.

Ungezielte Metabolomics-Messungen wurden mithilfe von FIA-TOF-MS mit einem Aufbau durchgeführt, der aus einer Agilent Series 1100 LC-Pumpe, gekoppelt an einen Gerstel MPS2-Autosampler und einem Agilent 6550 Accuracy Mass Q-TOF-Massenspektrometer unter Verwendung von Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization (Agilent Technologies) bestand. , betrieben im negativen Ionisationsmodus. Die Flussrate betrug 150 µl/min der mobilen Phase, bestehend aus Isopropanol/MilliQ-Wasser (60:40 v/v), gepuffert mit 1 mM Ammoniumfluorid. Darüber hinaus wurden der mobilen Phase 1 mM 3-Amino-1-propansulfonsäure und 1 µM Hexakisphosphazin (HP-0921; Agilent Technologies) als Online-Massenachsenkalibrierungsverbindungen zugesetzt. Das Injektionsvolumen betrug 5 µl, die Messungen erfolgten randomisiert und in Doppelinjektionen. Massenspektren wurden von m/z 50 bis m/z 1.700 mit einer Frequenz von 1,4 Spektren pro s für 0,48 Minuten unter Verwendung hochauflösender 4-GHz-Einstellungen aufgezeichnet. Die Elektrospray-Einstellungen waren wie folgt: Ionenspray-Spannung, 3,5 kV negativer Modus; Kapillartemperatur: 325 °C; Trocknungsgasfluss, 5 l min−1; und 30 psi Verneblerdruck. Die Fragmentor-, Skimmer- und Oktopolspannungen wurden auf 175, 65 bzw. 750 V eingestellt.

Stammlösungen von 138 gereinigten Einzelverbindungen, die von Sigma-Aldrich erhalten wurden, wurden hergestellt, indem sie separat entweder in MilliQ-Wasser, Ethanol-Wasser- oder Methanol-Wasser-Mischungen oder Dimethylsulfoxid gelöst und anschließend auf 600 µM gemischt wurden (eine vollständige Liste aller Standards finden Sie in der Ergänzung). Tabelle 1). Die Mischung wurde aliquotiert und bei 0,12 mbar bis zur vollständigen Trockenheit in einem SpeedVac-Aufbau (Christ) getrocknet und bei –80 °C gelagert. Arbeitslösungen wurden in MilliQ-Wasser mit 0,4 % (v/v) Essigsäure hergestellt und vor der Verwendung filtriert.

Kalibrierungskurven wurden aus einer 24-Punkt-Serienverdünnungsreihe über sieben Größenordnungen (von 17,9 pM bis 150 µM) in MilliQ-Wasser und, um Matrixeffekte zu bewerten, in einem gepoolten Studienprobenhintergrund erhalten. Hierzu wurde die verdünnte Matrix mit der seriell verdünnten Standardmischung versetzt. Die Standards wurden zu Beginn und am Ende der Messung im positiven und negativen Ionisationsmodus gemessen.

An Messungen aus der Standardverdünnungsreihe wurde eine lineare Regression der logarithmisch transformierten Ionenzahlen gegenüber den logarithmisch transformierten Konzentrationen durchgeführt, was die iterative Entfernung von bis zu sechs Verdünnungsschritten von der oberen Konzentrationsgrenze und 12 Datenpunkten von den unteren Verdünnungen ermöglichte Ziel ist es, den R2-Wert zu maximieren. Die untere Quantifizierungsgrenze und die obere Linearitätsgrenze wurden als niedrigste bzw. höchste akzeptierte Verdünnungsstufe bestimmt. Anschließend wurden die Metabolitenkonzentrationen auf der Grundlage der abgeleiteten Steigungen und Abschnitte berechnet. Für weitere Analysen wurden nur Werte im linearen Bereich berücksichtigt. Von 138 Metaboliten konnten anhand dieser Kriterien 128 zuverlässig nachgewiesen und quantifiziert werden. Für jeden einzelnen Metaboliten haben wir bis zu fünf verschiedene Modifikationen gemessen (deprotoniertes Anion, protoniertes Kation, Natriumadduktkation, Dimerkation und Dimernatriumadduktkation) und die Modifikation manuell basierend auf linearer Anpassung (höchster R2-Wert), linearem Bereich und Zuverlässigkeit ausgewählt Abdeckung innerhalb des Datensatzes (maximale Anzahl erkannter Proben). Die ausgewählten Modifikationen, die linearen Anpassungen der jeweiligen Standards und der endgültige Datensatz finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. Die Metabolitenkonzentrationen werden als \(\frac{{\mathrm{{nmol}}}}{{\mathrm{{mg.} angegeben }}\;{\mathrm{sample}}}}\).

Für LC-TOF-MS-Daten wurden Vorverarbeitung, Peakauswahl und Annotation mit der Software MassHunter Quantitative Analysis B.07.00 (Agilent Technologies) durchgeführt. Metaboliten wurden gemäß MetaCyc56 (https://metacyc.org/) klassifiziert. Weitere Datenanalysen, Statistiken und Visualisierung wurden nach dem Export der Rohdaten in MATLAB R2021b (MathWorks) mithilfe von Funktionen durchgeführt, die in die Toolboxen „Bioinformatik“ und „Statistik“ eingebettet sind. Grafiken, Illustrationen und Plots wurden mit Illustrator (Adobe) finalisiert.

Bei fünf SPF-Mäusen haben wir an fünf Stellen sowohl Schleim- als auch Lumeninhalte separat entnommen: Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm und Dickdarm. Nach der DNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers (QIAamp PowerFecal DNA Kit, Qiagen) wurden Amplifikate, die die variablen Regionen 3 und 4 des 16S-rRNA-Gens abdecken, unter Verwendung der degenerierten Primer 515FY und 806R gemäß den für das Earth Microbiome-Projekt ermittelten Protokollen hergestellt57,58,59 . Die PCR-amplifizierten Amplikons wurden gelgereinigt (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen) und Illumina-Sequenzierungsadapter und Barcodes wurden hinzugefügt, gefolgt von einer Bead-basierten Reinigung (AMPure Beads, Beckman Coulter). Die Proben wurden mit einem Illumina MiSeq im Functional Genomics Center Zürich sequenziert. Insgesamt 16.557.915 Sequenzierungsablesungen aus 72 Proben (Median = 173.616) dienten als Eingabe für die Inferenz von Amplikon-Sequenzvarianten (ASVs) unter Verwendung von dada2 v.1.14 (Ref. 60). Primersequenzen (515FY = GTGYCAGCMGCCGCGGTAA, 806R = GGACTACNVGGGTWTCTAAT) wurden mit Cutadapt v.2.8 (Ref. 61) entfernt und nur Inserts, die beide Primer enthielten und mindestens 75 Basen lang waren, wurden für die Downstream-Analyse aufbewahrt. Als nächstes wurden die Lesevorgänge mit der filterAndTrim-Funktion des dada2 R-Pakets qualitätsgefiltert (maxEE = 2, truncQ = 3, trimRight = (40, 40)). Die Funktionen learnErrors und dada wurden zur Berechnung der Stichprobeninferenz unter Verwendung von pool = pseudo als Parameter verwendet. Lesevorgänge wurden mit der Funktion „mergePairs“ zusammengeführt und Bimeras wurden mit der Funktion „removeBimeraDenovo“ entfernt (Methode = gepoolt). Die verbleibenden ASVs wurden dann taxonomisch mit dem IDTAXA-Klassifikator62 in Kombination mit der Silva v.138-Datenbank63, verfügbar unter http://www2.decipher.codes/Downloads.html, annotiert. Proben mit weniger als 1.000 Messwerten (insgesamt neun Proben) wurden für nachgelagerte Analysen nicht berücksichtigt. Die resultierende ASV-Häufigkeitstabelle wurde auf eine gemeinsame Sequenzierungstiefe (6.000 Lesevorgänge pro Probe; d. h. das Minimum aller 63 verbleibenden Proben) heruntergesampelt, um Unterschiede in der Sequenzierungstiefe zwischen Proben mithilfe der rrarefy-Funktion des veganen R-Pakets zu korrigieren. Abundanztabellen auf jeder taxonomischen Ebene wurden berechnet, indem die Abundanz der ASVs, die zu denselben Taxa gehören, addiert wurde.

Statistische Analysen wurden in MATLAB R2021b (MathWorks) unter Verwendung von Funktionen durchgeführt, die in die Toolboxen „Bioinformatik“ und „Statistik“ eingebettet sind. Werte zwischen zwei Gruppen (z. B. zwischen verschiedenen Stichprobenorten) wurden verglichen und statistische Signifikanzen mithilfe von Student-t-Tests für gepaarte Stichproben berechnet (implementiert in der MATLAB Statistics-Toolbox). Im Allgemeinen dienten fünf männliche Mäuse als biologische Replikate. Experimente wurden nicht wiederholt. Die genaue Anzahl der Proben, die zur Berechnung einer statistischen Differenz verwendet wurden, ist in jeder Abbildungslegende angegeben. Die Falscherkennungsrate wurde durch Korrektur der berechneten P-Werte für Mehrfachtests (Benjamini-Hochberg-Verfahren) kontrolliert, und korrigierte P-Werte ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Um die Funktionshäufigkeit innerhalb des Mikrobioms vorherzusagen, wurde PICRUSt2 v.2.5.1 (Ref. 38) für die analysierten ASVs (Ergänzungstabelle 10) verwendet, was eine Liste der Enzymklassifizierungsnummern für jeden erkannten Mikroorganismus ergab. Das vorhergesagte Stoffwechselnetzwerk des Mikrobioms wurde dann aus den Enzymklassifizierungslisten rekonstruiert und mit dem Stoffwechselnetzwerk von Mus musculus in KEGG unter Verwendung des Python-Pakets bioservices64 verglichen. Die gemessenen Metaboliten wurden einem der beiden Netzwerke zugeordnet, um ihren Ursprung vorherzusagen. Räumliche Korrelationen zwischen Mikroorganismen und Metaboliten über alle Probenstellen hinweg wurden für jedes Paar als Spearman-Koeffizient unter Verwendung des Python-Pakets Scipy v.1.9.3 (Ref. 65) berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohe LC-TOF-MS-Daten wurden bei MassIVE hinterlegt und sind unter dem Zugangscode MSV000091478 verfügbar (https://doi.org/10.25345/C5K06XB0Q). 16S-rRNA-Sequenzierungsdaten sind unter der BioProject-ID PRJNA944604 im NIH Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA944604) verfügbar. Die KEGG-Datenbank wurde als Ressource in den Metaboliten-Mikroben-Assoziationen verwendet. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken GS Guiral für die Unterstützung bei der Verarbeitung von Sequenzierungsdaten und die Bereitstellung methodenspezifischer Informationen. Wir danken A. Othman und K. Ortmayr für ihre Hilfe und Unterstützung bei der Einrichtung des Metabolomics-Workflows. Wir danken für die Teilfinanzierung durch das National Institute of Health RO1 (GM117324) in den USA, den Schweizerischen Nationalfonds (SNSF Sinergia CRSII5_177164) in den USA und AJM sowie das ETH Fellows-Programm (ETH Zurich Foundation) in den USA und JT.

Open-Access-Förderung durch die Eidgenössische Technische Hochschule Zürich.

Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich, Zürich, Schweiz

Karin HU Meier, Julian Trouillon, Tobias Fuhrer, Nicola Zamboni & Uwe Sauer

Abteilung für Viszeralchirurgie und Medizin, Inselspital, Universitätsspital Bern, Universität Bern, Bern, Schweiz

Hai Li und Andrew J. Macpherson

Institut für Mikrobiologie, ETH Zürich, Zürich, Schweiz

Melanie Lang & Shinichi Sunagawa

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Die USA und AJM haben das Projekt konzipiert. KHUM richtete den LC-TOF-MS-Workflow ein, führte Metabolomics- und 16S-Sequenzierungsprobenvorbereitung einschließlich Metabolitenextraktion, genomische DNA- und 16S-Amplikonvorbereitung, Metabolomics-Messungen, Metabolomics-Datenverarbeitung, Metabolomics- und Sequenzierungsdatenanalyse einschließlich Schreiben von Code durch und bereitete und visualisierte alle Metabolomik- und Sequenzierungsdaten. JT führte eine Analyse des gleichzeitigen Vorkommens von Metaboliten und Mikroben durch. HL führte Mausexperimente durch, verarbeitete mit Hilfe von KHUMML rohe Sequenzierungsdaten und leistete Analyseunterstützung. TF und NZ leisteten Unterstützung und Anleitung bei der Projektplanung, Messungen und Kommentaren zum Manuskript. SS und AJM gaben Kommentare zum Manuskript ab. KHUM und US haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Uwe Sauer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Metabolism dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handhabung: Ashley Castellanos-Jankiewicz, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a – Schematische Darstellung der 15 in dieser Studie verwendeten Probenahmestellen: eine Stelle im Magen, zehn Stellen im Dünndarm (drei im Zwölffingerdarm, vier im Jejunum und drei im Ileum) und vier Stellen im Dickdarm ( im Blinddarm und im aufsteigenden, transversalen und absteigenden Dickdarm). b – Aufteilung der MetaCyc-Chemikalienklassen auf alle 128 Metaboliten, die mit unserer in dieser Studie verwendeten LC-TOF-MS-Methode gemessen wurden (Ergänzungstabelle ST1). c – Hierarchische Clusteranalyse der Metabolitenhäufigkeit im Darmschleim männlicher SPF-Mäuse. Die Häufigkeiten für alle 128 quantifizierten Metaboliten werden als Z-Scores der normalisierten Konzentrationen angezeigt, gemittelt von fünf Mäusen an den 15 Probenahmestellen. Die Clusterbildung wurde auf der Grundlage euklidischer Abstände an Lumenproben durchgeführt (Abb. 1a) und führte zur Identifizierung von drei Hauptclustern, die den drei wichtigsten bekannten physiologischen Regionen des Verdauungstrakts entsprechen, nämlich Magen, Dünn- und Dickdarm. In dieser Heatmap hier sind Metaboliten entlang der y-Achse zum Vergleich in der Reihenfolge aus Abb. 1a sortiert. Metaboliten in den drei Hauptclustern sind gemäß MetaCyc farblich gekennzeichnet (wie in S1b; Ergänzungstabelle ST1). d – Metabolitenkonzentrationen von Arginin, Ornithin und Spermidin im SPF-Luminalgehalt und in Schleimproben des Dickdarms. Dargestellt sind 20 Datenpunkte (vier Dickdarmstellen, fünf männliche Mäuse), Boxplots zeigen die mittlere Metabolitenkonzentration mit einer dickeren Markierung, das 25. und 75. Perzentil werden durch die Box gekennzeichnet und Whiskers erstrecken sich auf die extremsten Datenpunkte, die nicht als Ausreißer gelten.

Quelldaten

a, b – Hierarchische Clusteranalyse der Metabolitenhäufigkeiten aus 10 Dünndarm-Luminalinhalts- (a) und Schleimproben (b) männlicher SPF-Mäuse. Die Häufigkeit von 128 Metaboliten wird als Z-Score normalisierter Konzentrationen dargestellt, gemittelt aus fünf männlichen Mäusen und drei Duodenum-, vier Jejunum- bzw. drei Ileumproben. Basierend auf diesen drei gemittelten Werten (Duodenum, Jejunum, Ileum) wurde eine hierarchische Clusterbildung durchgeführt. Signifikant verändernde Metaboliten sind mit Kästchen und Sternchen gekennzeichnet (p-Wert ≤ 0,05). Die P-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen Student-t-Tests mit gepaarten Stichproben berechnet und sind in der Ergänzungstabelle ST4 zu finden. Der Farbschlüssel der Heatmap zeigt eine geringe bis hohe relative Häufigkeit von Metaboliten im gesamten Dünndarm an. c – Verteilung der Spitzenkonzentrationen im Lumeninhalt (oben) und im Schleim (unten) des Dünndarms in Bezug auf die drei Regionen. Drei Balken bezeichnen die drei Regionen Duodenum, Jejunum und Ileum, die Y-Achse zeigt die Häufigkeit der in der jeweiligen Region auftretenden Spitzenmetabolitenkonzentrationen. Abkürzungen: Duo – Duodenum, Jej – Jejunum und Ile – Ileum.

Quelldaten

a, b – Hierarchische Clusteranalyse der Metabolitenhäufigkeiten aus vier Proben mit Lumeninhalt (a) und Schleim (b) im Dickdarm bei männlichen SPF-Mäusen. Die Häufigkeit von 128 Metaboliten wird als Z-Score normalisierter Konzentrationen angezeigt, gemittelt von fünf männlichen Mäusen pro Probenahmestelle im Dickdarm (Blinddarm, aufsteigender, transversaler und absteigender Dickdarm). Hierarchisches Clustering wurde nur für diese vier Werte durchgeführt. Signifikant verändernde Metaboliten sind mit Kästchen und Sternchen gekennzeichnet (p-Wert ≤ 0,05). Die P-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen Student-T-Tests mit gepaarten Stichproben berechnet. Der Farbschlüssel der Heatmap zeigt eine geringe bis hohe relative Häufigkeit von Metaboliten im gesamten Dickdarm an. c – Dargestellt ist die Verteilung der Spitzenkonzentrationen im Lumeninhalt (oben) und im Schleim (unten) des Dickdarms in Bezug auf die vier Regionen. Vier Balken bezeichnen die Regionen, die Y-Achse zeigt die Häufigkeit der in der jeweiligen Region auftretenden Spitzenmetabolitenkonzentrationen. Abkürzungen: cec – Blinddarm, acol – aufsteigender Dickdarm, tcol – transversaler Dickdarm und dcol – absteigender Dickdarm.

Quelldaten

a – Verteilung der Metabolitenkonzentrations-Fachänderungen im SPF im Vergleich zum keimfreien Vergleich in Lumeninhalts- und Schleimproben. Faltenänderungen werden pro Metabolit im jeweiligen Lebensraum für fünf männliche Mäuse und 15 Probenahmestellen berechnet, log2-transformiert, und ihre Verteilung wird als Konturdiagramm entlang der x-Achse angezeigt. Auf der y-Achse ist die Frequenz aufgetragen. Eine negative log2-fache Änderung weist auf eine höhere Metabolitenkonzentration bei keimfreien Mäusen hin, eine positive log2-fache Änderung weist auf eine höhere Konzentration bei männlichen SPF-Mäusen hin. In Grau sind alle absoluten Faltungsänderungen ≤ 2 markiert. b – Dickdarmkonzentration von Adenosin, 3-Hydroxybutyrat, Fucose/Rhamnose und Caproat in SPF und keimfreiem Lumeninhalt und Schleim. Die durchgezogenen Balken zeigen die mittlere Konzentration der Messungen von fünf männlichen Mäusen, gemittelt über die vier Dickdarmstellen. Die 20 entsprechenden Datenpunkte werden als Kreise angezeigt. Abkürzungen: FC – Fold Change; GF – keimfrei; Duo – Duodenum, Jej – Jejunum und Ile – Ileum; cont – Lichtinhalt; muc – Schleim.

Quelldaten

a – Log2-transformierte Faltungsänderungen der mittleren Dünndarmkonzentration von 42 Metaboliten mit Längsmustern im Dünndarm (siehe Abb. 3 für Beispielprofile, Abb. 5, Ergänzungstabelle ST4). Zwischen männlichen SPF- und männlichen keimfreien Proben wurden Faltenänderungen im Lumengehalt (linkes Feld) und Schleim (rechtes Feld) berechnet und über die 10 Probenahmestellen und fünf biologische Replikate gemittelt. Boxplots basieren daher auf 50 Datenpunkten, wobei die mittlere log2-fache Änderung in Blau angezeigt wird, das 25. und 75. Perzentil durch die Box gekennzeichnet werden, Whiskers sich auf die extremsten Datenpunkte erstrecken, die nicht als Ausreißer gelten, und Ausreißer mit dem Pluszeichen gekennzeichnet sind . Der graue Bereich stellt absolute log2-fache Änderungen ≤ 2 dar. b – Räumliche Metabolitenprofile des Lumeninhalts oder der Schleimkonzentrationen bei SPF- und keimfreien Mäusen. Linien mit schattiertem Bereich zeigen den gleitenden Durchschnitt des Mittelwerts ± Standardabweichung der Konzentrationsmessungen mit fünf männlichen Mäusen. Abkürzungen: FC – Fold Change; GF – keimfrei; duo – Duodenum, Jej – Jejunum, Ile – Ileum, Cec – Blinddarm und Col – Dickdarm.

Quelldaten

Gemeinschaftszusammensetzung und Unterschiede im gesamten Darm des männlichen SPF-Luminalgehalts (oberes Feld) und des Schleims (unteres Feld) an fünf Stellen: Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm und Dickdarm. Angezeigt werden die relativen Mikrobenhäufigkeiten in Prozent auf Familienebene. Die oberen 95 % der kommentierten Community-Mitglieder pro Probe werden separat angezeigt, Bakterienkategorien, die weniger als 5 % der Community repräsentieren, werden in „Sonstige“ gruppiert.

Quelldaten

Ergänzungstabellen 1–10 zusammengefasst in einer einzigen Arbeitsmappe mit zehn separaten Registerkarten. Zu den Daten gehören detaillierte Informationen über die Moleküle, spezifische Faltungsänderungen, P-Werte und andere Informationen, die den Haupttext und die Abbildungen unterstützen.

Verarbeitete und quantifizierte Metabolitendaten pro Probe.

Daten zur Metabolitenhäufigkeit, Ergebnisse aus der Hauptkomponentenanalyse (PC1 und PC2), statistische Quelldaten (P-Werte und Faltungsänderungen).

Statistische Quelldaten (P-Werte und Faltungsänderungen), Metabolitenkonzentrationsdaten.

Daten zur Metabolitenkonzentration.

Statistische Quelldaten (P-Werte und Faltungsänderungen), Metabolitenkonzentrationsdaten.

KEGG-Identifikatoren, statistische Quelldaten, Metabolitenkonzentrationsdaten.

Daten zur Metabolitenhäufigkeit, Daten zur Metabolitenkonzentration.

Daten zur Metabolitenkonzentration.

Statistische Quelldaten, Metabolitenkonzentrationsdaten.

Statistische Quelldaten (p-Werte und Faltungsänderungen), Metabolitenkonzentrationsdaten.

Daten zur mikrobiellen Häufigkeit.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Meier, KHU, Trouillon, J., Li, H. et al. Die Stoffwechsellandschaft des Darms männlicher Mäuse identifiziert verschiedene Nischen, die durch mikrobielle Aktivitäten bestimmt werden. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

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Eingegangen: 28. Juni 2022

Angenommen: 06. April 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

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