De-novo-Cholesterinbiosynthese in Bakterien

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2904 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eukaryoten produzieren hochmodifizierte Sterole, einschließlich Cholesterin, die für die Physiologie der Eukaryoten unerlässlich sind. Obwohl bekannt ist, dass nur wenige Bakterienarten Sterole produzieren, wurde nicht über die De-novo-Produktion von Cholesterin oder anderen komplexen Sterinen in Bakterien berichtet. Hier zeigen wir, dass das marine Myxobakterium Enhygromyxa salina Cholesterin produziert und liefern Hinweise auf weitere nachgelagerte Modifikationen. Durch bioinformatische Analyse identifizieren wir einen mutmaßlichen Cholesterin-Biosyntheseweg in E. salina, der weitgehend homolog zum eukaryotischen Weg ist. Experimentelle Beweise deuten jedoch darauf hin, dass die vollständige Demethylierung an C-4 durch einzigartige bakterielle Proteine ​​erfolgt, wodurch die bakterielle und die eukaryotische Cholesterinbiosynthese unterschieden werden. Darüber hinaus sind Proteine ​​aus dem Cyanobakterium Calothrix sp. NIES-4105 ist auch in der Lage, Sterole an der C-4-Position vollständig zu demethylieren, was darauf hindeutet, dass eine komplexe Sterolbiosynthese auch in anderen Bakterienstämmen zu finden ist. Unsere Ergebnisse offenbaren eine unbeachtete Komplexität der bakteriellen Sterinproduktion, die mit der von Eukaryoten konkurriert, und verdeutlichen die komplizierte evolutionäre Beziehung zwischen der Sterolbiosynthese in der bakteriellen und eukaryotischen Domäne.

Sterole sind eine Klasse allgegenwärtiger und essentieller eukaryotischer Lipide, die für eine Vielzahl physiologischer Funktionen wichtig sind, darunter Zellsignalisierung, Membranhomöostase und Entwicklungszeitsteuerung1,2,3. Die eukaryotische Sterinbiosynthese wurde eingehend untersucht und dabei komplexe Biosynthesewege aufgedeckt, darunter ein gemeinsamer Satz von Enzymen, die zur Herstellung ähnlicher Sterol-Endprodukte verwendet werden, die sich im Grad der Ungesättigtheit, Demethylierung und Alkylierung unterscheiden4,5. Die Reihenfolge der Reaktionen in diesen Biosynthesewegen bestimmt die Produktion und Akkumulation von Sterol-Zwischenprodukten, die eine regulatorische Rolle bei der Lipidhomöostase6,7, der nachgeschalteten Produktbiosynthese8 und der Stressreaktion9 spielen. Die chemischen Modifikationen, die zur Synthese von Cholesterin bei Wirbeltieren, Phytosterinen in Pflanzen und Ergosterin in Pilzen erforderlich sind, sind für die biophysikalischen Eigenschaften dieser Lipide von wesentlicher Bedeutung und beeinflussen die Lokalisierung und Membrandynamik in ihren jeweiligen Organismen10,11,12. Diese Sterole dienen auch als Verzweigungspunkt für die Biosynthese von nachgeschalteten Metaboliten. Oxidationsreaktionen sind an der Umwandlung von Sterolen in eine Vielzahl von Verbindungen beteiligt, darunter Oxysterole, Gallensäuren, Steroidhormone und Brassinosteroide, die alle als Liganden in verschiedenen Signalwegen fungieren können13,14,15. Eukaryoten konjugieren Sterole auch mit Zuckern, Proteinen und anderen Lipiden und erweitern so die Funktion von Sterinen weiter auf die Zellverteidigung, Energiespeicherung, Verdauung und Signalübertragung16,17,18. Insgesamt spiegelt die Komplexität der eukaryotischen Sterolbiosynthese die vielfältigen Funktionen und bedeutenden Rollen wider, die diese Lipide in der eukaryotischen Physiologie spielen.

Während die Sterolbiosynthese und -funktion in eukaryotischen Organismen gut untersucht wurde, sind die bakterielle Sterolsynthese und -funktion vergleichsweise wenig erforscht. Es ist bekannt, dass mehrere Bakterien, darunter aerobe Methanotrophe, Planctomyceten und verschiedene Myxobakterien, Sterole de novo produzieren19. Im Gegensatz zu Eukaryoten produzieren diese Bakterien größtenteils Lanosterol, Parkeol oder Cycloartenol, die anfänglichen Cyclisierungsprodukte der Oxidosqualencyclase (OSC)20,21,22. Einige Bakterien führen jedoch während der Sterolsynthese zusätzliche chemische Modifikationen durch; Methanotrophe Bakterien modifizieren Sterole in eindeutige monomethylierte Strukturen, die für Methylococcaceae spezifisch sind19, Sterol produzierende Planctomycetes konjugieren Sterole an ein nicht identifiziertes Makromolekül21 und mehrere Myxococcota23 produzieren Zwischenprodukte im Cholesterin-Biosyntheseweg, einschließlich Zymosterol19,22,24. Darüber hinaus haben phylogenomische Studien die Zahl potenzieller bakterieller Sterinproduzenten erhöht und die Gene identifiziert, die sowohl für die Zyklisierung als auch für nachgeschaltete Modifikationen in Phyla in der gesamten Bakteriendomäne erforderlich sind25,26. Mehrere dieser Bakterien besitzen das genetische Potenzial, die biosynthetisch komplexen Sterole zu produzieren, die mit Eukaryoten assoziiert sind, einschließlich Cholesterin. Lipidanalysen müssen jedoch das Vorhandensein dieser Sterole in Bakterien noch bestätigen5.

Die Diskrepanz zwischen der genomischen Fähigkeit zur komplexen Sterolproduktion und den beobachteten Sterinen in Bakterien veranlasste uns, umfassendere Lipidanalysen sterolproduzierender Bakterien durchzuführen. Frühere phylogenetische Studien und unsere eigene erste Analyse der Sterol-Biosynthese-Gene der marinen Myxobakterien Enhygromyxa salina deuteten auf das Potenzial für die Produktion von biosynthetisch komplexeren Sterinen hin, als wir bisher beobachtet haben. Wir gingen davon aus, dass frühere Analysen den bakteriellen Sterinbestand aufgrund begrenzter Biomasse und/oder unzureichender Lipidextraktionstechniken möglicherweise unterschätzt haben, was uns dazu motivierte, die Sterole in diesem Bakterium erneut zu analysieren. Ebenso wurde die Analyse der Cyanobakterien Calothrix sp. Das NIES-4105-Genom identifizierte eine Gruppe mutmaßlicher Sterol-Biosynthese-Gene, einschließlich derjenigen, die für die komplexe Sterol-Biosynthese erforderlich sind, was uns dazu veranlasste, unsere Sterol-Analyse auf dieses Bakterium auszudehnen.

In dieser Arbeit untersuchen wir erneut die Sterolanalyse in E. salina und zeigen die Fähigkeit zur Synthese von Cholesterin auf. Unsere bioinformatische Analyse identifizierte Homologe zu einigen, aber nicht allen Schritten der eukaryotischen Cholesterinbiosynthese und unterschied die bakterielle Cholesterinproduktion von der in Eukaryoten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die vollständige Demethylierung an C-4, ein wesentlicher Schritt in der eukaryotischen Sterinbiosynthese, durch unterschiedliche bakterielle Proteine ​​in E. salina erfolgt und dass Homologe, die im phylogenetisch unterschiedlichen Sterin produzierenden Bakterium Calothrix gefunden werden, ähnlich funktionieren. Insgesamt deuten unsere Analysen der Sterolbiosynthese in diesen phylogenetisch unterschiedlichen Bakterien auf eine komplexe Biologie hin, die der bakteriellen Cholesterinproduktion zugrunde liegt, und werfen umfassendere Fragen zur Sterolbiosynthese, -entwicklung und -funktion auf.

Wir haben zuvor die Produktion von Zymosterol, einem biosynthetischen Zwischenprodukt der Cholesterinsynthese, in Lipidextrakten des Myxobakteriums Enhygromyxa salina19 nachgewiesen. Allerdings handelt es sich bei E. salina um ein soziales Raubbakterium, das häufig auf festem Agar mit Ganzzellhefe kultiviert wird, was die Menge an Biomasse begrenzt, die für umfangreiche Lipidanalysen zur Verfügung steht27. Diese Kultivierungsbedingungen stellen auch eine potenzielle Quelle einer Sterolkontamination dar, da sowohl Agar als auch zusätzliche Hefe Sterole enthalten können. Um den Sterinbestand dieses Organismus besser beurteilen zu können, haben wir E. salina in einem flüssigen Medium gezüchtet, das mit ganzzelligen Escherichia coli angereichert war, die von Natur aus keine Sterole produzieren. Diese Kultivierungsbedingungen erhöhten die extrahierbaren Lipide um das 50-fache, was umfangreichere Analysen ermöglichte.

Wir haben zunächst freie Lipide aus der Biomasse von E. salina durch eine Bligh-Dyer-Extraktion extrahiert28. Diese ersten Analysen ergaben eine Vielzahl von Sterinen, einschließlich Cholesterin (Abb. 1a; ergänzende Abb. 1, ergänzende Abb. 2). Wir haben auch 4,4-Dimethylcholesta-8,24-dienol entdeckt, ein Zwischenprodukt, das nur an C-14 demethyliert ist, was darauf hindeutet, dass E. salina wie Pilze und Tiere eine C-14-Demethylierung vor der C-4-Demethylierung durchführt und nicht nach der Entfernung von C-14 erste C-4-Methylgruppe, wie Pflanzen5. Wir haben auch mehrere nachgeschaltete Zwischenprodukte entdeckt, die an C-24 ungesättigt sind, darunter Zymosterol, Cholesta-7,24-dienol und Desmosterol, aber keine an C-24 gesättigten Zwischenprodukte. Die Anreicherung von nur C-24-ungesättigten Zwischenprodukten lässt darauf schließen, dass E. salina den Bloch-Cholesterin-Biosyntheseweg begünstigt, bei dem die C-24-Reduktion als letzter Schritt der Cholesterin-Biosynthese erfolgt (ergänzende Abbildung 3)29. Die Quantifizierung von Cholesterin sowie der Zwischenprodukte Desmosterol und Zymosterol ergab, dass die Zwischenprodukte Konzentrationen aufweisen, die denen von Cholesterin ähneln oder höher sind (Ergänzungstabelle 1). Um eine mögliche Kontamination zu kontrollieren, extrahierten wir schließlich sowohl das Kulturmedium als auch konzentrierte zusätzliche E. coli ohne Bakterienbiomasse. Sowohl die Medien als auch die Extraktionskontrollen enthielten keine Sterole (ergänzende Abbildung 4).

a Gesamtionenchromatogramm der freien Sterole aus E. salina, extrahiert mit dem modifizierten Bligh-Dyer-Verfahren. Zu den identifizierten Sterinen gehörten Cholesterin (VII) sowie ungesättigte C-24-Zwischenprodukte (I-VI). b Gesamtionenchromatogramm von ether- und estergebundenen Sterinen, die aus E. salina-Lipidextrakten durch saure Hydrolyse freigesetzt werden. Durch die Hydrolyse wurden zusätzliche Sterole freigesetzt, darunter 25-Hydroxycholesterin (VIII) und andere mutmaßliche Hydroxysterine (gekennzeichnet mit einem Sternchen). Alle Lipide wurden zu Trimethylsilylgruppen derivatisiert. Massenspektren der identifizierten Sterole sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um E. salina auf potenzielle Sterolkonjugate zu untersuchen, hydrolysierten wir sowohl den Gesamtlipidextrakt (TLE) als auch die Zellbiomasse entweder mit einer methanolischen Base, die Ester-gebundene Lipide spaltet, oder mit Methanolsäure, die Ester- und Ether-gebundene Lipide spaltet30. Durch die Hydrolyse von TLE mit methanolischer Base wurden keine zusätzlichen Sterole freigesetzt, aber durch die Hydrolyse mit Methanolsäure wurden 25-Hydroxycholesterin (25-OHC) sowie zusätzliche Oxysterole und andere potenziell modifizierte Sterolverbindungen freigesetzt (Abb. 1b und ergänzende Abb. 5). Das Vorhandensein von Oxysterolen nach der Säurehydrolyse von TLE, nicht jedoch nach der Basenhydrolyse, legt nahe, dass diese Konjugationen durch eine Etherbindung vermittelt werden. Um die chemische Natur von Sterolkonjugaten weiter zu charakterisieren, trennten wir extrahierbare Lipide nach Polarität mittels Si-Gel-Säulenchromatographie und hydrolysierten Fraktionen mit Methanolsäure. Nach der Hydrolyse waren alle Sterole, einschließlich Hydroxysterine, nur in der Alkoholfraktion vorhanden, was darauf hindeutet, dass konjugierte Sterole eine ähnliche Polarität wie freie Sterole aufweisen. Die direkte Hydrolyse der Zellbiomasse mit methanolischer Base oder Säure veränderte das Sterolprofil von E. salina gegenüber dem der hydrolysierten TLEs nicht. Um zu bestätigen, dass diese zusätzlichen Sterole nicht die Produkte des Abbaus oder der Autooxidation während der Hydrolyse waren, haben wir zunächst Cholesterin- und Desmosterol-Standards mit Säure hydrolysiert und dabei keine Produktion von Hydroxysterolen festgestellt. Wir fügten auch butyliertes Hydroxytoluol (BHT) zu einer E. salina-Säurehydrolyseextraktion hinzu und konnten dennoch 25-Hydroxycholesterin und die anderen potenziell modifizierten Sterole nachweisen, die bei Extraktionen ohne BHT beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 6).

Die Produktion von Cholesterin durch E. salina veranlasste uns, nach einem mutmaßlichen Biosyntheseweg in seinem Genom zu suchen. Wir führten eine BLASTp-Suche (<1 × e−30, 30 % ID) nach Sterolbiosyntheseproteinen aus Eukaryoten und Bakterien durch4,31. Wir haben einen restriktiven Grenzwert für diese BLASTp-Suchen gewählt, um besser sicherzustellen, dass identifizierte Proteine ​​wahrscheinlich an der Sterolbiosynthese beteiligt sind, da Proteine ​​im Cholesterinbiosyntheseweg zu großen Superfamilien gehören, die Funktionen außerhalb der Sterolbiosynthese umfassen5. Wir haben Homologe für nahezu jeden Schritt im eukaryotischen Cholesterin-Biosyntheseweg im Genom von E. salina entdeckt (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 2), obwohl eine weitere biochemische Charakterisierung erforderlich ist, um zu zeigen, dass die identifizierten Proteine ​​keine zusätzlichen Reaktionen in der Zelle durchführen. Bemerkenswert ist, dass Sterol-Biosynthesegene nicht in Genclustern lokalisiert sind, wie dies bei anderen Sterol-produzierenden Bakterien beobachtet wird, sondern stattdessen an separaten Orten im gesamten Genom zu finden sind (ergänzende Abbildung 7). Mithilfe dieses neu konstruierten Cholesterin-Biosynthesewegs suchten wir als nächstes nach Homologen in anderen Bakterien mit nachgewiesener genomischer Fähigkeit zur Sterolproduktion (<1 × e−50, 30 % ID). Wir identifizierten 103 Bakterienisolate und 21 metagenomassemblierte Genome mit Squalenmonooxygenase (SMO) und Oxidosqualencyclase (OSC), den ersten konkreten Schritten in der Sterolbiosynthese. Von diesen OSC- und SMO-haltigen Bakteriengenomen und Metagenomen weisen nur die anderen sequenzierten Isolate von E. salina die erforderlichen Homologen für den eukaryotischen Cholesterinbiosyntheseweg auf, was darauf hindeutet, dass die Cholesterinproduktion wahrscheinlich ein gemeinsames Merkmal dieser E. salina-Arten ist (Ergänzende Daten 1). .

Homologe zu den kanonischen eukaryontischen Proteinen für die Cholesterinbiosynthese wurden durch BLASTp-Suche identifiziert (<1 × e−30, 30 % ID; Ergänzungstabelle 2). In der Biomasse von E. salina identifizierte Sterole sind fett gedruckt. E. salina weist keine Homologen zu den eukaryotischen Enzymen auf, die für die C-4-Demethylierung und C-25-Hydroxylierung verantwortlich sind. Bakterielle Enzyme für die vollständige C-4-Sterol-Demethylierung und C-25-Hydroxylierung wurden nicht identifiziert und sind mit einem Fragezeichen gekennzeichnet. Der genomische Kontext für identifizierte E. salina-Gene ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Während E. salina einen Großteil seines Cholesterin-Biosynthesewegs mit Eukaryoten teilt, weist es keine Homologen zu den drei eukaryotischen Proteinen auf, die für die C-4-Demethylierung verantwortlich sind. Stattdessen weist E. salina Homologe zum Dioxygenase-Reduktase-Paar SdmAB auf, das von aeroben Methanotrophen verwendet wird, um nur eine einzige Methylgruppe an C-431 zu entfernen. Um zu testen, ob die SdmAB-Homologen von E. salina ausreichen, um beide Methylgruppen an C-4 zu entfernen, wie es für die Produktion von Cholesterin erforderlich ist, verwendeten wir ein heterologes Expressionssystem in einem E. coli-Stamm, der so konstruiert war, dass er das Substrat Lanosterin überproduziert (Abb. 3a). )33. Die alleinige Expression des SdmA-Homologs führte zur Produktion eines 4-Methylaldehyd-Zwischenprodukts. Die alleinige Expression des SdmB-Homologs erzeugte keine Demethylierungszwischenprodukte (Ergänzende Abbildungen 8 und 9). Interessanterweise führte die Koexpression der SdmAB-Homologen nicht zur Entfernung von Methylgruppen an C-4 (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass diese beiden Proteine ​​nicht ausreichen, um Lanosterol an der C-4-Position in E. salina und vollständig zu demethylieren Unterscheidung von SdmAB in E. salina von den Homologen, die in aeroben Methanotrophen gefunden werden.

a Gesamtionenchromatogramme, die die Lanosterol (I)-Substratproduktion in unserem heterologen E. coli-Expressionssystem zeigen. b Koexpression von SdmAB-Homologen aus E. salina, was zur Produktion nur eines 4-Methylaldehyd-Zwischenprodukts (III) führt. Diese beiden Enzyme reichen nicht aus, um an C-4 zu demethylieren, was sie von SdmAB-Homologen in aeroben Methanotrophen unterscheidet. c Koexpression von SdmAC-Homologen aus E. salina, was zur Entfernung einer einzelnen Methylgruppe an C-4 führt. d Koexpression von SdmABC-Homologen aus E. salina, was zu einer vollständigen Demethylierung an C-4 führt. Lipide wurden zu Trimethylsilylgruppen derivatisiert. C-4-Demethylierungszwischenprodukte wurden in einer früheren Studie bestätigt und hier durch Vergleich mit veröffentlichten Massenspektren identifiziert (32). Massenspektren der identifizierten Sterole sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes versuchten wir herauszufinden, ob das Fehlen der C-4-Demethylierung durch die Homologen von E. salina mit SdmA oder SdmB zusammenhängt. Dazu nutzten wir die SdmA- und SdmB-Homologen von Methylococcus capsulatus – die zusammen eine einzelne Methylgruppe in unserem Expressionssystem entfernen – und exprimierten sie mit ihrem reziproken SdmA- oder SdmB-Partner aus E. salina. Die Expression von SdmA aus E. salina mit SdmB aus M. capsulatus führte zur Entfernung einer einzelnen Methylgruppe an C-4, während die Expression von SdmB aus E. salina mit SdmA aus M. capsulatus zu keiner Demethylierung an C-4 führte (Ergänzung). Abb. 10). Daher schlagen wir vor, dass das SdmA-Homolog von E. salina die zur Demethylierung erforderlichen Oxygenierungsreaktionen durchführen kann, das SdmB-Homolog von E. salina jedoch nicht ausreicht, um sowohl die Decarboxylierungs- als auch die Reduktionsreaktionen durchzuführen, die für die Demethylierung an der C-4-Position erforderlich sind. Diese Ergebnisse veranlassten uns, E. salina erneut auf Enzyme zu untersuchen, die das Potenzial haben, die Decarboxylierungs- und Reduktionsreaktionen durchzuführen.

Durch eine zusätzliche BLASTp-Suche im Genom von E. salina identifizierten wir eine weitere Reduktase vom SDR-Typ, die homolog zu SdmB ist, SdmC (1 × e−120, 51 % Identität), beschränkt auf die Myxococcota-Unterordnung Nannocystaceae (ergänzende Abbildung 11). Die alleinige Expression von SdmC führte nicht zur Akkumulation von Demethylierungszwischenprodukten (ergänzende Abbildung 8). Allerdings führte die Koexpression von SdmC mit SdmA aus E. salina zur Entfernung einer einzelnen Methylgruppe an C-4, was darauf hindeutet, dass SdmC in der Lage ist, die oxidierte Methylgruppe zu decarboxylieren und das verbleibende Keton an C-3 unverändert zu einer Hydroxylgruppe zu reduzieren gezeigt für den M. capsulatus SdmB (Abb. 3c)31. Darüber hinaus führt die Koexpression von SdmC mit E. salina SdmAB zur Entfernung beider Methylgruppen an C-4 und zur Bildung zusätzlicher Demethylierungszwischenprodukte (Abb. 3d). Somit unterscheidet sich die vollständige Demethylierung an der C-4-Position in E. salina sowohl von der bakteriellen C-4-Demethylierung in aeroben Methanotrophen als auch in Eukaryoten (ergänzende Abbildung 12).

Während SdmC auf eine bestimmte myxobakterielle Unterordnung beschränkt zu sein scheint, können SdmAB-Homologe in einer Vielzahl von isolierten und durch Metagenome erworbenen Genomen (MAGs) in der gesamten Domäne gefunden werden. Dazu gehören 31 Bakterien aus fünf verschiedenen Phyla (Ergänzungsdaten 1). Wir wollten herausfinden, ob diese anderen SdmAB-Homologen ebenfalls ausreichen, um Lanosterol zu verdoppeln, oder ob sie ähnlicher wie die SdmAB-Homologen in aeroben Methanotrophen funktionieren und nur eine einzige Methylgruppe an C-4 entfernen. Insbesondere das Cyanobakterium Calothrix sp. Das NIES-4105-Genom enthält SdmAB-Homologe in einem 21-kb-Gencluster, der auch Homologe für die Produktion von Oxidosqualen, die Zyklisierung, die Demethylierung von C-14, die Isomerisierung von C-8 und mehrere zusätzliche Proteine ​​enthält, die wahrscheinlich an der Sterolbiosynthese beteiligt sind (Abb. 4a und Ergänzungstabelle 2). ). Diese Vielfalt an Sterol-Biosynthese-Genen in einem Cyanobakterium wurde bisher nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieser Calothrix-Stamm komplexe Sterole produzieren könnte, die an der C-4-Position vollständig demethyliert sind. Um dies zu testen, haben wir zunächst das Calothrix-osc-Homolog in einem Oxidosqualen-produzierenden E. coli-Stamm heterolog exprimiert, was zur Lanosterinproduktion führte und bestätigte, dass die Calothrix-Cyclase funktionsfähig ist (ergänzende Abbildung 13). Als nächstes exprimierten wir die Calothrix-SdmAB-Homologen, um zu bestimmen, ob diese Proteine ​​zur Demethylierung an C-4 fähig waren. Die alleinige Expression des SdmA-Homologs führte zur Produktion eines 4-Methylaldehyd-Zwischenprodukts, während die alleinige Expression des SdmB-Homologs zur Produktion von Lanosteron führte (Ergänzende Abbildungen 8 und 9). Die Koexpression von Calothrix SdmAB reichte aus, um beide Methylgruppen an C-4 zu entfernen, was einen dritten bakteriellen C-4-Demethylierungsweg zeigt, der sich von E. salina, aeroben Methanotrophen und Eukaryoten unterscheidet (Abb. 4b und ergänzende Abb. 12).

a Sterol-Biosynthesegene in Calothrix sind in einem einzelnen Gencluster lokalisiert. Gene, die durch unsere BLAST-Suche identifiziert wurden, sind rot markiert und Textbeschriftungen sind fett gedruckt. Bemerkenswert sind mehrere andere Gene, die als mutmaßliche Biosynthesegene gelten und möglicherweise für die Durchführung zusätzlicher Schritte in der Cholesterinbiosynthese verantwortlich sind. b Gesamtionenchromatogramme der Lanosterolsubstratproduktion in unserem heterologen Expressionssystem und der Koexpression von SdmAB-Homologen aus Calothrix, was zu einer vollständigen Demethylierung an C-4 führt. Lipide wurden zu Trimethylsilylgruppen derivatisiert. C-4-Demethylierungszwischenprodukte wurden in einer früheren Studie bestätigt und hier durch Vergleich mit veröffentlichten Massenspektren identifiziert (32). Massenspektren der identifizierten Sterole sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Angesichts der genetischen und biochemischen Beweise für die komplexe Sterinproduktion in Calothrix analysierten wir als nächstes die von diesem Bakterium produzierten Sterole. In unserer ersten Analyse konnten wir Sterole erst nach saurer Hydrolyse der Zellbiomasse nachweisen (Ergänzende Abbildungen 1, 2 und 13). Zu diesen Sterinen gehörten Cholesterin sowie sowohl ungesättigte C-24- als auch gesättigte C-24-Zwischenprodukte. Wir haben auch 25-OHC in hydrolysierten Calothrix-Extrakten identifiziert, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass in Calothrix möglicherweise Sterole konjugiert sind. Im Laufe der Lipidanalysen stellte Calothrix jedoch die gesamte Sterolproduktion ein. Um festzustellen, ob der Verlust der Sterolproduktion in Calothrix auf eine genetische Mutation im Sterol-Biosynthese-Gencluster zurückzuführen ist, sequenzierten wir das Genom des seriell passagierten Stamms und verglichen es mit dem Referenzgenom von Calothrix sp. NIES-4105. Wir entdeckten 14 Mutationen im Genom des seriell passagierten Stamms im Vergleich zum Referenzgenom, das in den Datenbanken JGI IMG und NCBI verfügbar ist. Keine dieser Mutationen trat jedoch im Sterolbiosynthese-Gencluster oder stromaufwärts davon auf (Ergänzungstabelle 3). Während diese Ergebnisse unsere anfängliche Sterinanalyse von Calothrix nicht schlüssig machen, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Cyanobakterien eine potenzielle Quelle biosynthetisch komplexer Sterole und ein Stamm sind, der bei der Untersuchung der bakteriellen Sterinbiosynthese weiter berücksichtigt werden sollte.

In dieser Studie zeigen wir, dass Bakterien die Fähigkeit besitzen, Cholesterin de novo zu synthetisieren. Dies weist eine biosynthetische Komplexität auf, die häufig mit Eukaryoten in Verbindung gebracht wird, und legt die Möglichkeit nuancierter physiologischer Funktionen von Sterinen in Bakterien nahe. Unsere Analyse von E. salina identifizierte Cholesterin sowie Zwischenprodukte im Cholesterin-Biosyntheseweg. Die Quantifizierung dieser Lipide zeigt, dass biosynthetische Zwischenprodukte in höheren oder ähnlichen Konzentrationen wie Cholesterin selbst auftreten. Dies unterscheidet sich von der Cholesterinproduktion in vielen Eukaryoten, wo Zwischenprodukte vorhanden sein können, jedoch oft in Konzentrationen, die um Größenordnungen niedriger sind als Cholesterin oder andere „Endprodukte“-Sterine34,35. Angesichts der hohen Konzentrationen dieser Zwischenprodukte in diesem Bakterium im Vergleich zu Cholesterin gehen wir davon aus, dass Cholesterinzwischenprodukte wie Desmosterol und Zymosterol selbst als funktionelle Lipide dienen. Welche Funktionen diese haben und ob sie sich vom Cholesterin unterscheiden, bleibt jedoch unklar.

Unsere Analysen von Calothrix lieferten genomische und biochemische Beweise für die Fähigkeit zur komplexen Sterolproduktion, die Sterolproduktion durch dieses Bakterium bleibt jedoch ungewiss. Historisch gesehen war die De-novo-Sterol-Biosynthese in Cyanobakterien umstritten. Frühe Sterolanalysen von Cyanobakterien deuteten auf eine Fähigkeit zur komplexen Sterolbiosynthese hin36. Es mangelte jedoch an unterstützenden genomischen Beweisen und in mehreren Fällen wurde später nachgewiesen, dass die Sterolproduktion durch eine Pilzkontamination verursacht wurde37,38. Unsere Arbeit, die die Funktionalität von Sterol-Biosyntheseproteinen aus Calothrix demonstriert, kombiniert mit bioinformatischen Daten, die eine ähnliche genetische Kapazität in anderen Cyanobakterien zeigen, regt die zukünftige Untersuchung der in diesen Bakterien vorkommenden biosynthetischen Enzyme und die weitere Analyse der von ihnen produzierten Sterole an. Darüber hinaus haben wir die Gene identifiziert, die für die komplexe Sterolbiosynthese, einschließlich der C-14- und C-4-Demethylierung, in einer Vielzahl von Bakterien erforderlich sind, darunter andere Myxobakterien und Cyanobakterien sowie Actinobakterien, Acidobakterien und Nitrospirea (Ergänzende Daten 1). Bei vielen dieser Bakterien muss die Sterolproduktion noch analysiert werden. Die Verbindung einer robusteren Lipidanalyse mit weiteren Untersuchungen der bakteriellen Sterinbiosynthese würde es uns ermöglichen, die Verteilung, Vielfalt und Komplexität von Sterinen in Bakterien besser zu verstehen.

Das Vorhandensein freier und konjugierter Sterole in E. salina ist ein weiteres Beispiel für die biosynthetische Komplexität der bakteriellen Sterinproduktion. Die bakterielle Sterolkonjugation ist nicht auf E. salina beschränkt; andere Bakterien konjugieren Sterole, entweder als Produkt der De-novo-Biosynthese21 oder als Modifikation exogen erworbener Sterole39,40. Diese unterschiedlichen Sterinpools lassen auf das Potenzial für vielfältige physiologische Rollen von Sterinen in Bakterien schließen. Konjugationen mit anderen Makromolekülen beeinflussen die biophysikalischen Eigenschaften von Sterinen41 und in eukaryotischen Systemen sind diese modifizierten Lipide an spezifischen Funktionen beteiligt, einschließlich der Lipidspeicherung und der Zellabwehr16,17. Während in sterolproduzierenden Bakterien keine intakten Sterolkonjugate identifiziert wurden, können die in Eukaryoten und Bakterien identifizierten Sterolkonjugate, die in der Lage sind, exogene Sterole zu modifizieren, Aufschluss über die Arten von Molekülen geben, die in diesen sterolproduzierenden Bakterien vorhanden sein könnten. Dazu gehören Sterylglucoside, die sowohl in Eukaryoten35 als auch in Sterol-modifizierenden Bakterien39 identifiziert wurden, und Sterolester, die unseres Wissens nur in Eukaryoten16,42,43 gefunden wurden. Die Ausweitung der Extraktionstechniken zur Analyse von Sterollipiden, zur Identifizierung vorhandener Sterolkonjugate und zur Erforschung von Enzymen, die für nachgeschaltete Modifikationen verantwortlich sind, würde eine bessere Bewertung der konjugierten Steroldiversität in der Bakteriendomäne ermöglichen und gleichzeitig eine Grundlage für die weitere Erforschung der Sterolfunktion bieten.

Die Cholesterinproduktion durch Bakterien weist auch auf eine komplizierte Evolutionsgeschichte der Sterolbiosynthese im bakteriellen Bereich hin. Die komplexe Sterolbiosynthese ist ein uralter Prozess; Es wird angenommen, dass sich die Oxidosqualencyclase (OSC), die für die Sterolcyclisierung verantwortlich ist, um das Große Oxidationsereignis herum entwickelt hat32 und die heutigen eukaryontischen Sterolbiosynthesegene stammen wahrscheinlich aus der Zeit vor dem letzten gemeinsamen Vorfahren der Eukaryonten5. Es wurde angenommen, dass die Sterol-Biosynthese in Bakterien ein Produkt des horizontalen Gentransfers von Eukaryoten ist, was durch ihre Seltenheit und ungleichmäßige Verteilung innerhalb der Bakterienstämme gestützt wird32. Neuere phylogenetische und strukturelle Analysen von OSC und der C-14-Demethylase (CYP51) legen jedoch einen bakteriellen Ursprung für diese Proteine ​​nahe25,26,44. Der von uns identifizierte mutmaßliche Cholesterin-Biosyntheseweg von E. salina ist weitgehend homolog zum eukaryotischen Weg, was auf eine gemeinsame Evolutionsgeschichte eines Großteils der Cholesterinbiosynthese zwischen diesem Myxobakterium und Eukaryoten hinweist, obwohl unsere Analyse keinen Einblick in die Richtung des Erwerbs liefert. Wir haben jedoch mehrere Cholesterin-Biosyntheseproteine ​​identifiziert, die an der Entsättigungsmodifikation beteiligt sind, und diese Proteine ​​wurden in phylogenetischen Analysen nicht berücksichtigt (Supplementary Data 1). Weitere biochemische und phylogenetische Analysen dieser nachgeschalteten Proteine ​​könnten die evolutionären Beziehungen, die die Sterolproduktion in diesen beiden Domänen steuern, besser aufklären.

Die bakterielle C-4-Demethylierung ist weiterhin ein eindeutiges Beispiel für die unabhängige Entwicklung der Sterolbiosynthese. Wir identifizierten Proteine, die für die vollständige C-4-Demethylierung in E. salina und Calothrix verantwortlich sind und sich von denen in Eukaryoten, aeroben Methanotrophen und untereinander unterscheiden. In Eukaryoten ist die C-4-Demethylierung eine sauerstoffabhängige Reaktion, die von drei Proteinen durchgeführt wird – einer C-4-Sterolmethyloxidase (ERG25/SMO), einer C-4-Decarboxylase (ERG26/3β-HSD/D) und einem 3-Ketosteroid Reduktase (ERG27/3-SR)45,46,47. Alle drei Proteine ​​sind an einem iterativen Prozess beteiligt, der nacheinander beide Methylgruppen an der C-4-Position entfernt, obwohl gezeigt wurde, dass Pflanzen zwei unterschiedliche SMO-Proteine ​​verwenden, um jede Methylgruppe auf nicht sequentielle Weise zu entfernen48. Wir haben zuvor gezeigt, dass die C-4-Demethylierung bei aeroben Methanotrophen zur Entfernung einer Methylgruppe führt und durch eine Oxygenase vom Rieske-Typ, SdmA, und eine NADP-abhängige Reduktase, SdmB31, durchgeführt wird. Obwohl sowohl E. salina als auch Calothrix Homologe von SdmA und SdmB enthielten, war unklar, ob diese beiden Proteine ​​ausreichen würden, um beide Methylgruppen an der C-4-Position zu entfernen. Wir zeigen, dass die beiden Calothrix-Homologen tatsächlich ausreichen, um beide Methylgruppen an C-4 zu entfernen, E. salina jedoch eine zweite Reduktase zur vollständigen Demethylierung benötigt. Diese Enzyme sind nicht homolog zu den kanonischen eukaryotischen Proteinen und belegen, dass die Cholesterinbiosynthese in diesen Bakterien kein einfacher Fall eines horizontalen Gentransfers ist. Vielmehr handelt es sich um einen Fall konvergenter Evolution in der Sterolbiologie, der eine entscheidende Rolle der C-4-Sterol-Demethylierung für die Sterolfunktion in beiden Lebensbereichen impliziert. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die C-4-Demethylierung für die ordnungsgemäße Funktion in Eukaryoten erforderlich ist, da C-4-Demethylase-Mutationen oft tödlich sind45,49,50. Unklar bleibt, welche funktionelle Rolle die C-4-Demethylierung in Bakterienzellen spielt und ob sie für die ordnungsgemäße Sterolfunktion, wie sie bei Eukaryoten beobachtet wird, erforderlich ist. Eine weitere biochemische und strukturelle Charakterisierung der verschiedenen bakteriellen C-4-Demethylierungswege sollte vergleichende Einblicke in die funktionelle Bedeutung dieser Modifikation liefern.

Schließlich ist die komplexe Sterinbiosynthese in Bakterien auch für ihre möglichen industriellen und biomedizinischen Anwendungen von Interesse. Es wurde vermutet, dass die Produktion von zyklischen Triterpenoidlipiden, einschließlich Hopanoiden in Bakterien und Sterolen in Pilzen, die Widerstandsfähigkeit dieser Mikroben gegenüber den verschiedenen Belastungen erhöht, denen sie unter industriellen Kultivierungsbedingungen ausgesetzt sind, einschließlich Temperatur- und Ethanolstress51,52. Ein besseres Verständnis der Sterol-Biosynthesegene und die Entwicklung von Sterol-Expressionssystemen bieten weitere Möglichkeiten, Mikroben besser für industrielle Anwendungen zu entwickeln. Darüber hinaus produzieren mehrere Myxobakterien, darunter auch andere Isolate von E. salina, von Steroiden abgeleitete Sekundärmetaboliten mit nachgewiesenen antimikrobiellen Eigenschaften53,54,55. Allerdings sind Myxobakterien, insbesondere solche aus Meeresumgebungen wie E. salina, oft schwer zu kultivieren, genetisch unkontrollierbar und produzieren Sekundärmetaboliten in geringen Konzentrationen56. Dies hat zu einem erhöhten Interesse am Verständnis der Biosynthesewege von Naturstoffen in diesen Organismen und an der Entwicklung heterologer Systeme zur Herstellung dieser Verbindungen geführt57. Die Erforschung der Steroidbiosynthese in Myxobakterien könnte weitere neue Biosyntheseenzyme aufdecken und gleichzeitig einen Rahmen für eine bessere Produktion dieser Verbindungen bieten. Darüber hinaus bietet das modulare heterologe Expressionssystem, das wir hier zur Erforschung der C-4-Demethylierung verwenden, die Möglichkeit, biosynthetische Zwischenprodukte in der Cholesterinbiosynthese zu überproduzieren, von denen viele ansonsten kommerziell nicht verfügbar oder unerschwinglich teuer sind. Diese biosynthetischen Zwischenprodukte haben sich für die Untersuchung der Cholesterinbiosynthese, -regulation und -funktion in Eukaryoten als nützlich erwiesen und haben in einigen Fällen klinische Auswirkungen58. Die weitere Charakterisierung der bakteriellen Cholesterinbiosynthese unter Verwendung dieser heterologen Systeme wird weitere Werkzeuge zur besseren Untersuchung von Sterinen in anderen Organismen entwickeln und gleichzeitig Einblicke in umfassendere Fragen rund um die Sterolbiologie und -evolution liefern.

Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind im SI-Anhang, Tabelle S4 aufgeführt. E. salina DSM 15201 wurde in 20 ml Seawater Salts (SWS)-Medium, pH 7, in einem Erlenmeyerkolben, ergänzt mit autoklavierten und konzentrierten Ganzzell-E. coli, bei 30 °C unter Schütteln mit 225 U/min (Thermo Scientific, MaxQ8000) kultiviert ), für 14 Tage27. Zur Herstellung der konzentrierten Ganzzell-E. coli wurde E. coli DH10B in einem Erlenmeyerkolben in 500 ml LB-Medium bis zu einer OD600 zwischen 1,0 und 1,5 gezüchtet. Dieser E. coli wurde pelletiert, in 50 ml SWS resuspendiert und autoklaviert. Im Laufe von 14 Tagen wurden 5 ml dieser konzentrierten E. coli-Suspension der E. salina-Kultur zugeführt, während das Medium klar wurde59. Calothrix sp. NEIS-4105 wurde in 20 ml BG-11-Flüssigmedium, pH 760, in einem Erlenmeyerkolben bei 25 °C 60 Tage lang mit 10-stündigen Licht- und 14-stündigen Dunkelzyklen kultiviert. Heterologe Expressionsstämme von E. coli wurden in 25 ml TYGPN-Medium bei 30 °C oder 37 °C unter Schütteln bei 225 U/min kultiviert und bei Bedarf mit Gentamycin (15 μg/ml), Kanamycin (30 μg/ml) ergänzt. Carbenicillin (100 μg/ml) und/oder Chloramphenicol (20 μg/ml).

Ungebundene Sterole wurden aus lyophilisierten Zellpellets durch eine modifizierte Bligh-Dyer-Extraktion28 extrahiert. Die Pellets wurden 1 Stunde lang in 10:5:4 (Vol.:Vol.:Vol.) Methanol:Dichlormethan (DCM):Wasser beschallt. Anschließend wurden die Lipide unter Verwendung des zweifachen Volumens 1:1 (Vol.:Vol.) DCM:Wasser phasengetrennt. Die organische Phase wurde übertragen und unter N2-Gas eingedampft, was Gesamtlipidextrakte (TLE) ergab. Gegebenenfalls wurde TLE nach Polarität mittels Si-Chromatographie über das folgende Säulenschema fraktioniert: 1,5 Säulenvolumina Hexane, 2 Säulenvolumina 8:2 (Vol.:Vol.) Hexan:DCM, 2 Säulenvolumina DCM, 2 Säulenvolumina 1: 1 (Vol.:Vol.) DCM: Ethylacetat, 2 Säulenvolumina Ethylacetat, was jeweils eine Alkin-, unpolare, Keton-, Alkohol- und polare Fraktion ergibt61.

Gebundene Sterole wurden analysiert, indem entweder Lipidextrakte, Si-Gel-Chromatographiefraktionen oder lyophilisierte Zellpellets in 1 N HCl oder KOH in Methanol hydrolysiert und 3 Stunden lang auf 75 °C erhitzt wurden. Die Reaktionen wurden mit KOH bzw. HCl neutralisiert und die Phasen mit dem doppelten Volumen von 1:1 (Vol.:Vol.) DCM:Wasser getrennt. Die organische Phase wurde überführt und unter N2-Gas eingedampft. Gegebenenfalls wurde Butylhydroxytoluol (BHT) den Säurehydrolyseproben in einer Endkonzentration von 0,01 % (Gew.:Vol.) BHT:MeOH62 zugesetzt.

Die Konzentrationen von Cholesterin, Desmosterol, Zymosterol und 25-Hydroxycholesterin (25OCH) in den Proben wurden mithilfe einer Standardkurve im Bereich von 10 ng bis 100 ng quantifiziert. Der Sterolgehalt wurde anhand der Standardkurve berechnet und auf das Trockenzellgewicht jeder Probe normalisiert. Darüber hinaus wurde die Nachweisgrenze für Sterole auf unserem Massenspektrometer durch Verdünnen einer Sterol-Standardmischung auf 1–5 ng festgelegt.

Alle Lipide wurden unter Verwendung von 1:1 (Vol.:Vol.) Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid:Pyridin und 1-stündigem Erhitzen auf 70 °C vor der Analyse auf einem Agilent 7890B Series GC zu Trimethylsilylethern derivatisiert. Die Lipide wurden auf einer 60 m langen Agilent DB17HT-Säule (60 m x 0,25 mm Innendurchmesser x 0,1 µm Filmdicke) mit Helium als Trägergas bei einem konstanten Fluss von 1,1 ml/min getrennt und wie folgt programmiert: 100 °C für 2 Minuten; dann 8 °C/min auf 250 °C und 10 min gehalten; dann 3 °C/min auf 330 °C und 17 min gehalten. Insgesamt wurden 2 μl jeder Probe im Splitless-Modus bei 250 °C injiziert. Der GC war an einen MSD der Serie 5977 A gekoppelt, wobei die Ionenquelle bei 230 °C lag und bei 70 eV im EI-Modus betrieben wurde, wobei in 0,5 s ein Bereich von 50–850 Da gescannt wurde. Lipide wurden mit Agilent MassHunter Qualitative Analysis (B.06.00) analysiert und anhand der Retentionszeit und Spektren durch Vergleich mit zuvor bestätigten Laborstandards, veröffentlichten Spektren31,63,64 und bei der American Oil Chemists' Society (AOCS) hinterlegten Spektren identifiziert Bibliothek (http://lipidlibrary.aocs.org/index.cfm) oder die Datenbanken des National Institute of Standards and Technology (NIST).

Die in dieser Studie verwendeten Plasmide und Oligonukleotide sind in der Ergänzungstabelle 5 und der Ergänzungstabelle 6 beschrieben. Oligonukleotide wurden von Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) erworben. Genomische DNA aus E. salina wurde mit dem GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) isoliert. Genomische DNA von Calothrix sp. NEIS-4105 wurde mithilfe einer Phenol-Chloroform-Extraktion65 isoliert, wobei ein Volumen von 25:24:1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (Vol.: Vol.: Vol.) zur Biomasse gegeben, zentrifugiert und die wässrige Schicht entfernt wurde. Dies wurde zweimal wiederholt, bevor genomische DNA mit dem doppelten Volumen an 70 %igem Ethanol ausgefällt wurde. Plasmid-DNA wurde mit dem GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) isoliert. Beim Klonen verwendete DNA-Fragmente wurden mit dem GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) isoliert. Die DNA wurde von ELIM Biopharm (Hayward, CA) sequenziert.

Plasmide wurden durch sequenz- und ligationsunabhängiges Klonen (SLIC)66 konstruiert. Kurz gesagt, komplementäre Überhänge wurden auf gelgereinigten PCR-Produktinserts und einem mit Restriktionsenzymen linearisierten Vektor durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase (EMD Milipore) in Abwesenheit von Nukleotiden erzeugt. Darauf folgte eine Annealing-Reaktion und Transformation ohne Ligation. E. coli-Stämme wurden durch Elektroporation mit einem MicroPulser-Elektroporator (BioRad) gemäß den Empfehlungen des Herstellers transformiert.

Sterol-Biosynthesegene wurden in E. coli aus kompatiblen Plasmiden mit entweder einem IPTG-induzierbaren lac- oder einem Arabinose-induzierbaren araBAD-Promotor überexprimiert33. Heterologe Expressionsstämme wurden wie in der Ergänzungstabelle 7 beschrieben konstruiert. Gene von Interesse wurden aus dem IPTG-induzierbaren Plasmid pSRKGm-lacUV5-rbs5 und/oder dem Arabinose-induzierbaren Plasmid pBAD1031K exprimiert. E. coli-Stämme wurden bei 37 °C in 20 ml TYGPN-Medium, ergänzt mit Antibiotika (nach Bedarf), bis zur mittleren exponentiellen Phase kultiviert, in der die Expression mit 500 μM IPTG und 0,2 % (Gew.:Vol.) Arabinose für 30–40 Stunden induziert wurde bei 30 °C unter Schütteln bei 225 U/min, vor der Zellernte.

Um Sterolbiosynthesegene in E. salina und Calothrix zu identifizieren, führten wir eine BLASTp-Suche67 durch. Um als mutmaßliches Sterol-Biosynthese-Gen zu gelten, haben wir einen E-Wert-Grenzwert von 1 x e−30 und einen prozentualen Identitäts-Grenzwert von 30 festgelegt. BLASTp-Suchergebnisse sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Um andere Bakterien zu identifizieren, die die Sterol-Biosynthese-Gene enthielten Wir identifizierten E. salina und Calothrix und führten zunächst eine BLASTp-Suche nach Bakterien in den Genomdatenbanken auf dem JGI IMG-Portal (https://img.jgi.doe.gov/) für OSC (<1 × e −50, 30 % Ausweis). Für diese Untergruppe von Bakterien führten wir weitere BLASTp-Suchen durch (<1 × e−50, 30 % ID) unter Verwendung identifizierter Proteine ​​aus E. salina und Calothrix68,69. Ein benachbarter Baum von SdmBC-Homologen wurde durch Angleichen von Proteinsequenzen mithilfe von MUSCLE in MEGA (11.0.10) generiert. Der phylogenetische Baum wurde dann mithilfe des Gammamodells, vier Gammaratenkategorien und 500 Bootstrap-Replikaten erstellt.

Die Bibliotheksvorbereitung (Illumina DNA Prep Kit; San Diego, CA) und die Sequenzierung des gesamten Genoms wurden von SeqCenter (SeqCenter; Pittsburgh, PA) durchgeführt und auf einem Illumina NextSeq 2000 sequenziert, was 2x151-bp-Reads ergab. Bclconvert (v3.9.3) wurde zum Demultiplexen, zur Qualitätskontrolle und zum Trimmen verwendet. Um Mutationen im seriell passagierten Stamm zu identifizieren, wurde ein Variantenaufruf mit breseq (v0.35.4)70 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Daten werden in den Dateien „Zusätzliche Informationen“ und „Quelldaten“ bereitgestellt. Die JGI IMG (https://img.jgi.doe.gov/)-Gen-IDs für Sterol-Biosynthese-Gene in E. salina und Calothrix sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die Quelldatendatei enthält die Rohdaten des Gesamtionenchromatogramms, die zur Generierung verwendet wurden Haupttext und ergänzende Abbildungen sowie die Rohdaten der Massenspektrometrie, die zur Generierung ergänzender Spektrendaten verwendet werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken den Mitgliedern des Welander-Labors für hilfreiche Diskussionen. Die Finanzierung dieser Studie erfolgte durch den National Science Foundation Award 1919153 (an PVW).

Abteilung für Erdsystemwissenschaften, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Alysha K. Lee, Jeremy H. Wei und Paula V. Welander

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AKL, JHW ​​und PVW konzipierten Forschung; AKL und JHW führten Untersuchungen durch; AKL, JHW ​​und PVW analysierten Daten; und AKL, JHW ​​und PVW haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Paula V. Welander.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Miguel C. Santoscoy und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, AK, Wei, JH & Welander, PV De-novo-Cholesterinbiosynthese in Bakterien. Nat Commun 14, 2904 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

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Eingegangen: 20. Oktober 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

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