Ein Mücken-AgTRIO-mRNA-Impfstoff trägt zur Immunität gegen Malaria bei

npj Vaccines Band 8, Artikelnummer: 88 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Malaria entsteht, wenn eine infizierte Mücke Speichel, der Plasmodium-Sporozoiten enthält, in die Haut eines Wirbeltiers injiziert. Um Malaria vorzubeugen, ist die Impfung die wirksamste Strategie, und es besteht ein dringender Bedarf an neuen Strategien zur Verbesserung aktueller Impfstoffe auf Krankheitserregerbasis. Eine aktive oder passive Immunisierung gegen ein Mückenspeichelprotein, AgTRIO, trägt zum Schutz vor einer Plasmodium-Infektion von Mäusen bei. In dieser Studie haben wir ein AgTRIO-mRNA-Lipid-Nanopartikel (LNP) erzeugt und seinen potenziellen Nutzen als Impfstoff gegen Malaria bewertet. Die Immunisierung von Mäusen mit einem AgTRIO-mRNA-LNP erzeugte eine starke humorale Reaktion, einschließlich AgTRIO-IgG2a-Isotyp-Antikörpern, die mit Schutz in Verbindung gebracht wurden. Mit AgTRIO mRNA-LNP immunisierte Mäuse, die mit Plasmodium berghei infizierten Mücken ausgesetzt waren, hatten im Vergleich zu Kontrollmäusen deutlich geringere anfängliche Leberinfektionsraten mit Plasmodium und eine höhere Überlebensrate. Da die humorale Reaktion auf AgTRIO über sechs Monate nachließ, steigerten zusätzliche Mückenstiche außerdem die AgTRIO-IgG-Titer, einschließlich der IgG1- und IgG2a-Isotypen, was einen einzigartigen Vorteil im Vergleich zu Impfstoffen auf Krankheitserregerbasis bietet. Diese Daten werden bei der Entwicklung zukünftiger Malaria-Impfstoffe helfen, die sowohl Krankheitserreger- als auch Vektorantigene enthalten können.

Malaria beim Menschen kann durch mindestens fünf verschiedene Arten von Plasmodium1 verursacht werden. Um eine Infektion zu verhindern, ist die Impfung die wirksamste Strategie. Allerdings wurde bisher kein hochwirksamer Malaria-Impfstoff entwickelt2,3,4. Mehrere Impfstoffkandidaten befinden sich in klinischen Studien. Einer der fortschrittlichsten Impfstoffe – der erst 2021 von der WHO zugelassen wurde – ist ein auf Krankheitserregern basierender Impfstoff, RTS,S. RTS,S zielt auf das Plasmodium falciparum Circumsporozoite-Protein (PfCSP) in Verbindung mit immunstimulierenden Epitopen des Hepatitis-B-Oberflächenantigens und AS01-Adjuvans5. Die Schutzwirksamkeit ist mäßig, mit einer 30–50 %igen Reduzierung der Infektionen in klinischen Studien, und der Schutz lässt mit der Zeit nach5,6,7,8. Darüber hinaus ist der Schutz auf P. falciparum beschränkt und es besteht immer noch das Risiko einer Infektion durch andere Plasmodium-Arten – zwei Schwächen, die die Möglichkeit einer Malaria-Eradikation einschränken9. Darüber hinaus macht es das weit verbreitete Auftreten von Arzneimittelresistenzen bei Malariaparasiten und Insektizidresistenzen bei Mückenüberträgern erforderlich, Strategien zur Identifizierung von Impfstoffzielen zu entwickeln, die mit CSP synergetisch wirken oder unabhängig von CSP wirken.

Malaria wird übertragen, wenn eine infizierte weibliche Anopheles-Mücke eine Blutmahlzeit zu sich nimmt und Plasmodium-Sporozoiten zusammen mit Speichel in die Haut des Wirbeltierwirts injiziert10,11. Nach einem Mückenstich wandern Sporozoiten innerhalb der Blutgefäße zur Leber, wo sie in Hepatozyten eindringen und eine Infektion auslösen12. Mückenspeichel enthält biologisch aktive Moleküle, die die Immun- und hämostatischen Reaktionen des Wirts modulieren13,14,15,16,17,18,19,20 und möglicherweise auch eine Plasmodium-Infektion beeinflussen. Es gibt Berichte über enge Wechselwirkungen zwischen Proteinen in den Speicheldrüsen von Anopheles-Mücken und Plasmodium vor und nach der Migration von Plasmodium aus der Mücke21,22,23,24. Es wurde auch gezeigt, dass Hyperimmunseren gegen Speicheldrüsenextrakte von Mücken einen hohen Titer an Antikörpern gegen Komponenten im Speichel enthalten können, die bei einem natürlichen Mückenstich normalerweise nicht antigen sind, und dass solche Seren einen gewissen Schutz gegen die Übertragung von Plasmodium bieten können23. Insbesondere haben wir mindestens ein Antigen, AgTRIO aus dem Speichel von Anopheles gambiae, identifiziert, das Antikörper hervorruft, die die Malariainfektion sowohl in einem traditionellen Mausmodell als auch in einem humanisierten Mausmodell für Malaria verringern23. AgTRIO-Antikörper bieten auch synergistischen Schutz, wenn sie mit einem monoklonalen CSP-Antikörper23 kombiniert werden. Diese Studien legen nahe, dass die Immunisierung gegen AgTRIO zum Schutz vor einer Plasmodium-Infektion beitragen und in Kombination mit Pathogen-Immunogenen nützlich sein könnte.

mRNA-Impfstoffe stellen einen wichtigen technologischen Fortschritt zur Vorbeugung von Infektionskrankheiten dar, wie die SARS-CoV2-Pandemie gezeigt hat25,26. Mehrere Studien mit mRNA-Impfstoffen gegen PfCSP haben ihre Nützlichkeit, wenn auch ohne vollständigen Schutz, in Mausmodellen einer Plasmodium-Infektion bewiesen27,28,29. Darüber hinaus ist die gezielte Bekämpfung mehrerer Antigene mit mRNA-Impfstoffen leicht möglich29,30,31, was möglicherweise eine stärkere Antimalariareaktion hervorrufen kann, um einen PfCSP-basierten Impfstoff zu verbessern. Wir haben ein Lipid-Nanopartikel (LNP) hergestellt, das eine mRNA enthält, die für das Mückenspeichelprotein AgTRIO kodiert. Die Immunisierung von C57BL/6-Mäusen mit dem AgTRIO-mRNA-LNP-Impfstoff verringerte die anfängliche Plasmodiumbelastung in der Leber und die anschließende Parasitämie nach Exposition gegenüber Plasmodium-infizierten Mücken. Darüber hinaus kann die IgG-Reaktion gegen AgTRIO durch Mückenstiche verstärkt werden, was möglicherweise ein Problem im Zusammenhang mit der Schutzdauer bei Impfstoffen auf Krankheitserregerbasis lösen könnte. Basierend auf diesen Daten könnte ein AgTRIO-mRNA-LNP-Impfstoff als Teil eines Multiantigen-Impfstoffansatzes gegen Malaria nützlich sein.

Um festzustellen, ob AgTRIO-mRNA-LNP AgTRIO-spezifische Antikörper erzeugen kann, wurden C57BL/6-Mäuse dreimal mit 10 μg AgTRIO-mRNA-LNP oder der Kontrolle Luciferase (Luc) mRNA-LNP immunisiert (Abb. 1a). Zwei Wochen nach jeder Injektion wurde Blut gesammelt und durch einen Enzymimmunoassay (ELISA) unter Verwendung eines gereinigten, aus E. coli stammenden AgTRIO analysiert (Abb. 1b). Die Immunisierung mit AgTRIO mRNA-LNP erzeugte nach der ersten Auffrischimpfung signifikante IgG-Reaktionen. Um festzustellen, ob die Immunisierung zu Antikörpern führte, die natives AgTRIO erkannten, sammelten wir Speicheldrüsenextrakte (SGE) von weiblichen Anopheles gambiae und beschichteten dann Platten mit SGE für ELISA. Die Immunisierung mit AgTRIO-mRNA-LNP erzeugte signifikante Antikörper gegen SGE (Abb. 1c). In unserer aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass die IgG-Unterklasse des monoklonalen AgTRIO-Antikörpers (mAb) die Schutzwirkung gegen eine Plasmodium-Infektion beeinflussen kann32. Insbesondere ein muriner IgG2a-mAb gegen AgTRIO bot den stärksten Schutz32. Durch ELISA fanden wir heraus, dass das AgTRIO-mRNA-LNP verschiedene Antikörperisotypen gegen AgTRIO erzeugte, einschließlich IgG2a-Antikörper (Abb. 1d).

ein Versuchsschema, das Gruppen weiblicher C57BL/6-Mäuse zeigt, denen 10 μg AgTRIO-mRNA-LNP oder Kontroll-mRNA (Luc mRNA-LNP) injiziert und zweimal im Abstand von zwei Wochen geboostet wurden. b Zwei Wochen nach jeder Immunisierung wurde den Mäusen Blut entnommen. 1:2.500- und 1:12.500-Verdünnungen der Seren wurden mittels ELISA unter Verwendung von rekombinantem AgTRIO als Antigen auf AgTRIO-spezifische IgG-Antikörper untersucht. c 1:2.500-Verdünnung der nach dem Finale gesammelten Seren wurde mittels ELISA auf AgTRIO-spezifische IgG-Antikörper gegen Speicheldrüsenextrakte untersucht. (Median ± IQR, p < 0,05 unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests) d 1:2.500-Verdünnung der Seren wurde verwendet, um AgTRIO-spezifisches IgG1, IgG2a und IgG2b zu bestimmen. 1:500-verdünnte Seren wurden auf AgTRIO-spezifische IgG3-Antikörper untersucht.

In unserer vorherigen Studie bot die aktive Immunisierung mit AgTRIO oder der passive Transfer mit AgTRIO-Antiseren einen teilweisen Schutz gegen durch Mücken übertragene Plasmodium-Infektionen bei Mäusen23. Um festzustellen, ob die Immunisierung mit AgTRIO-mRNA-LNP die Plasmodium-Infektion beeinflussen kann, haben wir C57BL/6-Mäuse mit 10 μg immunisiert AgTRIO mRNA-LNP dreimal im Abstand von zwei Wochen. Die Kontrollgruppe erhielt 10 μg Luc RNA-LNP. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung provozierten wir die Mäuse mit jeweils 3 P. berghei-infizierten A gambiae-Mücken. Mit AgTRIO-mRNA-LNP immunisierte Mäuse wiesen im Vergleich zu mit Luc-mRNA-LNP immunisierten Mäusen einen um 68 % verringerten mittleren P. berghei-Leberspiegel auf (Abb. 2a, p = 0,048). Um die Auswirkungen dieses AgTRIO-mRNA-LNP auf die Entwicklung späterer Stadien einer Malariainfektion, wie z. B. Parasitämie, weiter zu untersuchen, haben wir eine zusätzliche Gruppe von Mäusen dreimal mit entweder 10 μg AgTRIO-mRNA-LNP oder Luc-mRNA-LNP immunisiert und dann exponiert die Tiere an drei mit P. berghei infizierte Mücken. 5 Tage nach der Exposition gegenüber infizierten Mückenstichen gab es in der Gruppe, die den AgTRIO-mRNA-LNP-Impfstoff erhielt, deutlich weniger Parasitämie (Abb. 2b, p = 0,012). Anschließend verwendeten wir Kaplan-Meier-Überlebenskurven, um die Kinetik einer 0,01 %igen Parasitämie als Beweis für eine Infektion zu demonstrieren (Abb. 2c). In Übereinstimmung mit der Leberbelastung und den Ergebnissen der Parasitämie am 5. Tag gab es in der Gruppe, denen der AgTRIO-mRNA-LNP-Impfstoff verabreicht wurde, weniger infizierte Mäuse (p = 0,036 gemäß Log-Rank-Test). Alle diese Daten zeigen, dass die Immunisierung mit AgTRIO mRNA-LNP die hepatische Plasmodiumbelastung im Mausmodell deutlich reduzieren und zum Schutz vor Malaria beitragen kann.

C57BL/6-Mäuse wurden dreimal mit 10 µg AgTRIO-mRNA-LNP oder Kontroll-mRNA (Luc) immunisiert. Drei Wochen nach der letzten Impfung wurden die immunisierten Mäuse drei mit P. berghei infizierten Mücken ausgesetzt. a Nach 40 Stunden wurden die Lebern präpariert und der Grad der Plasmodium-Infektion durch RT-PCR bestimmt. (Median ± IQR, p < 0,05 unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests). b In einem separaten Experiment mit Mäusen, die auf die gleiche Weise geimpft und infizierten Mückenstichen ausgesetzt waren, wurden die Parasitämiewerte am Tag 5 nach der Infektion bestimmt. (Median ± IQR, p < 0,05 unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests). c Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurden verwendet, um den Prozentsatz nicht infizierter Mäuse darzustellen. Mittels Durchflusszytometrie wurde festgestellt, dass die Infektion 0,01 % der Parasitämie ausmachte. p = 0,036 durch Log-Rank-Test zwischen den beiden Gruppen.

Da AgTRIO stark im Speichel von Mücken exprimiert wird23, haben wir anschließend untersucht, ob die nach jeder Impfung natürlich auftretenden abnehmenden IgG-Reaktionen – im Fall von AgTRIO – durch Mückenstiche verstärkt werden können. Wir immunisierten C57BL/6-Mäuse mit drei Dosen AgTRIO-mRNA-LNP und bestimmten in regelmäßigen Abständen IgG-Titer. Bis 18 Wochen nach Beginn der Experimente (14 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung) waren die IgG-Titer gegen AgTRIO (Median: 0,45) um etwa 40 % gesunken, verglichen mit 10 Wochen nach Beginn der Experimente (Median: 0,716). Abb. 3a). Anschließend wurde eine Gruppe von Mäusen 3 Wochen lang wöchentlich 10 nicht infizierten Mückenstichen ausgesetzt, und die Kontrollgruppe von Mäusen wurde AgTRIO nicht ausgesetzt. Bei der Fütterung von Mäusen wurden bei wiederholten Mückenstichen keine signifikanten Nebenwirkungen festgestellt. Die Anti-AgTRIO-IgG-Konzentration stieg in der Gruppe, die Mückenstichen ausgesetzt war, deutlich an, während die IgG-Spiegel in der Kontrollgruppe weiter abnahmen (Abb. 3a, p = 0,03 nach dem Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test). Als nächstes bestimmten wir, welche IgG-Unterklassen des AgTRIO-spezifischen Antikörpers durch Mückenstiche verstärkt wurden. Durch ELISA waren AgTRIO-spezifisches IgG1 und IgG2a nach Mückenstichen signifikant erhöht (Abb. 3b). Diese Ergebnisse zeigen, dass Mückenstiche die IgG-Reaktion gegen AgTRIO nach der Immunisierung aufrechterhalten können, einschließlich IgG-Isotypen, die mit Schutz in Verbindung gebracht wurden32.

Einer Gruppe von Mäusen wurden 10 μg AgTRIO-mRNA-LNP oder Kontroll-mRNA (Gluc-mRNA-LNP) injiziert und über einen Zeitraum von 4 Wochen zweimal geboostet. Die Seren wurden 10, 18 und 25 Wochen nach Beginn der Experimente gesammelt. Eine 1:2.500-Verdünnung der Seren wurde mittels ELISA auf Gesamt-AgTRIO-spezifische IgG-Antikörper untersucht. b Eine 1:2.500-Verdünnung der Seren wurde verwendet, um AgTRIO-spezifisches IgG1, IgG2a und IgG2b zu bestimmen. 1:500-verdünnte Seren wurden auf AgTRIO-spezifische IgG3-Antikörper untersucht. (Median ± IQR, p < 0,05 unter Verwendung des Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Tests). Roter Balken: nach 18 Wochen dreimal wöchentlich 10 Mücken ausgesetzt. Blauer Balken: Nichtbelichtung.

Bei der Suche nach Blutmehl scheiden Mücken Speichel aus, um die Nahrungsaufnahme zu erleichtern, und gleichzeitig werden Sporozoiten in die Haut freigesetzt10,11. Daher können Bestandteile des Speichels direkt oder indirekt die Übertragung von Plasmodium an der Bissstelle beeinflussen und sind potenzielle Ziele für die Krankheitsprävention23,33. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass eine passive oder aktive Immunisierung gegen eines der Speichelproteine, AgTRIO, einen teilweisen Schutz gegen P. berghei und P. falciparum bietet, die durch Mückenstiche von A. gambiae oder A. stephensi übertragen werden23. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass AgTRIO stark im Speichel von Mücken ausgeschieden wird und dass Mücken, bei denen AgTRIO durch RNAi zum Schweigen gebracht wurde, Sporozoiten im Vergleich zu Kontrollmücken nicht effizient auf die Haut von Mäusen übertragen22,23. Dies macht AgTRIO zu einem geeigneten Kandidaten für die Aufnahme in einen Mehrkomponenten-Impfstoff. In dieser Studie haben wir ein AgTRIO-mRNA-LNP generiert, das AgTRIO-spezifische humorale Reaktionen induziert, einschließlich IgG2a-Isotyp-Antikörpern, die mit Schutz in Verbindung gebracht wurden32. Das AgTRIO mRNA-LNP reduzierte die Plasmodium-Infektion bei Mäusen deutlich. Unsere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Immunisierung gegen AgTRIO mithilfe eines mRNA-Ansatzes zum Schutz vor der Übertragung von Plasmodium vom Arthropoden auf einen Wirbeltierwirt beitragen kann.

In unserer vorherigen Studie hatten Mäuse, die mit AgTRIO-Protein in vollständigem Freund-Adjuvans immunisiert und dann mit AgTRIO-Protein mit unvollständigem Freund-Adjuvans geboostert wurden, eine um 50 % geringere Leberbelastung im Vergleich zur Kontrollgruppe23. In derselben Studie hatten 66 % der mit AgTRIO immunisierten Mäuse eine nachweisbare Parasitämie, verglichen mit 95 % der Kontrollmäuse23. Während Freunds Adjuvans für den Nachweis des Prinzips nützlich ist, da es stark immunstimulierend ist, kann es aufgrund seiner toxischen Nebenwirkungen nicht an Menschen verabreicht werden. Unter Verwendung des AgTRIO-mRNA-Ansatzes erreichten 44,4 % (4/9) der Mäuse, die AgTRIO-mRNA-LNP erhielten, nach der Belastung einen Parasitämiewert von 0,01 %, verglichen mit 88,8 % (8/9) der Kontrollgruppe. In unserer vorherigen Studie bot ein monoklonaler IgG2a-AgTRIO-Antikörper im Vergleich zu den anderen monoklonalen Isotyp-Antikörpern einen erheblichen Schutz gegen Plasmodium-Infektionen bei Mäusen, und der Schutz hing von der Fc-Region ab32. In unseren unveröffentlichten Ergebnissen gab es nach der Immunisierung mit AgTRIO-Protein und Alaun-Adjuvans AgTRIO-spezifische IgG1- und IgG2b-Reaktionen, es gab jedoch keine signifikante IgG2a-Reaktion. AgTRIO-mRNA LNP sorgt für eine robuste IgG-Isotyp-Reaktion, einschließlich der Bildung von IgG2a-Antikörpern, die möglicherweise einen wirksameren Schutz gegen eine Plasmodium-Infektion bieten. Alle diese Ergebnisse zeigen, dass der AgTRIO-mRNA-LNP-Ansatz im Vergleich zu proteinbasierten Impfstoffen Vorteile bieten kann.

Darüber hinaus kommt es nach einer Infektion oder Impfung mit der Zeit zu einem Nachlassen der schützenden Immunantwort, was die größte Sorge darstellt. Beispielsweise lässt die humorale Reaktion bei den meisten COVID-19-Impfstoffen nach 6 Monaten um mehr als 50 % nach34,35,36,37,38. Um schützende humorale Reaktionen aufrechtzuerhalten, ist ein Auffrischungsimpfstoff erforderlich. Ähnlich wie andere Impfstoffe weisen PfCSP-basierte Impfstoffe mit der Zeit einen nachlassenden Schutz auf6,7. Während die humorale Reaktion auf AgTRIO nach 6-monatiger Immunisierung abnahm, konnten die Antikörper durch Mückenstiche verstärkt werden. Andererseits gibt es nach wiederholten Mückenstichen weder beim Menschen noch bei Mäusen eine signifikante humorale Immunantwort gegen AgTRIO23, was darauf hindeutet, dass der verstärkende Effekt nur nach dem Priming durch aktive Immunisierung mit AgTRIO eintritt. In unserer Studie wurden bei wiederholten Mückenstichen nach der Immunisierung mit dem AgTRIO-mRNA-LNP-Impfstoff keine signifikanten Nebenwirkungen wie Rötung, Schwellung oder allergische Reaktion festgestellt. Es ist jedoch wichtig, die Sicherheit direkt beim Menschen zu untersuchen, da die Ergebnisse bei Mäusen nicht immer direkt mit denen beim Menschen korrelieren. Dieser natürlich erworbene verstärkende Effekt verleiht der AgTRIO-basierten Immunisierung einen einzigartigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Impfstoffen auf Krankheitserregerbasis. In Malaria-Endemiegebieten könnte eine anhaltende Exposition gegenüber dem Vektor die AgTRIO-Antikörper bei mit AgTRIO-mRNA-LNP geimpften Personen leicht erhöhen und aufrechterhalten. Insgesamt zeigt unsere Studie, dass eine mRNA-Impfstoffstrategie, die auf ein Mückenspeichelprotein abzielt, bei der Entwicklung der nächsten Generation von Impfstoffen gegen Malaria helfen kann und in Verbindung mit herkömmlichen Impfstoffen auf Plasmodiumbasis eingesetzt werden kann.

A. gambiae-Mücken (Stamm 4arr) wurden bei 27 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit, in einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gezüchtet und mit 10 % Saccharose unter Standardlaborbedingungen im Insektarium der Yale University gehalten. Swiss Webster- und C57BL/6-Mäuse wurden von Charles River Laboratories gekauft. Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care & Use Committee der Yale University genehmigt (Protokollnummer: 2022–07941). Alle Plasmodium-Infektionen wurden in Tierhaltungseinrichtungen der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt. Alle Tierversuche folgten dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council. In allen Experimenten wurden Mäuse in von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditierten Tiereinrichtungen an der Yale University untergebracht und gepflegt. Zur retroorbitalen Blutentnahme oder Mückenfütterung wurden Mäuse mit intraperitonealer Injektion von Ketamin/Xylazin (100 mg/10 mg pro kg Körpergewicht) anästhesiert. Als die gesamten Experimente abgeschlossen waren, wurden die Mäuse mithilfe einer CO2-Kammer gemäß den AVMA-Richtlinien für Euthanasie eingeschläfert. Nach dem Tod wurde den Mäusen als sekundäres Mittel, um den Tod sicherzustellen, eine Zervixluxation unterzogen.

AgTRIO (AGAP001374) ohne Signalpeptid wurde zwischen der 22. und 389. Aminosäure codonoptimiert und dann wurden AgTRIO- oder Luciferase-mRNAs (Kontrolle) so transkribiert, dass sie 101 Nukleotide lange Poly(A)-Schwänze enthielten. N-1-Methylpseudouridin (m1Ψ-5′)-triphosphat anstelle von UTP wurde verwendet, um modifizierte nukleosidhaltige mRNA zu erzeugen. Das Capping der in vitro transkribierten mRNAs wurde co-transkriptionell unter Verwendung des Trinukleotid-cap1-Analogs CleanCap durchgeführt. mRNA wurde durch Cellulosereinigung gereinigt39. Die mRNA wurde dann in LNPs unter Verwendung einer wässrigen Lösung von mRNA bei saurem pH-Wert 4,0 eingekapselt und mit einer Lösung von Lipiden40,41, bestehend aus einem ionisierbaren kationischen Lipid/Phosphatidylcholin/Cholesterin/PEG-Lipid (50:10:38,5:1,5 Mol), gemischt /mol)28,29,30,31. Zur Einkapselung wurde RNA mit den Lipiden in einem Verhältnis von etwa 0,05 (Gew./Gew.) gemischt. Das LNP hatte einen Durchmesser von ∼80 nm, gemessen durch dynamische Lichtstreuung mit einem Zetasizer Nano ZS-Instrument (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK) und wird bei –80 ° C gelagert.

Fünf Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse wurden entweder mit 10 µg AgTRIO-mRNA-LNP oder der Kontrolle (Luc mRNA-LNP) immunisiert und erhielten dann zwei und vier Wochen später Auffrischungsimpfungen mit der gleichen Menge Impfstoff. Zwei Wochen nach jeder Immunisierung wurde von jeder Maus Serum entnommen und die IgG-Antworten mithilfe eines ELISA getestet, um antigenspezifische Antikörper zu bestätigen. Um festzustellen, ob ein Mückenstich das IgG steigern kann, ließen wir nach dem Abfall der AgTRIO-IgG-Titer 10 nicht infizierte Mücken die Mäuse fressen. Die Kontrollmäuse waren keinen Mücken ausgesetzt.

Die Belastung von Lebern durch Plasmodium nach einer Sporozoiteninfektion wurde durch Bestimmung des Expressionsniveaus von P. berghei 18 S rRNA, normalisiert auf M. musculus Hepatozyten-Kernfaktor 4 Alpha, hnf4α, bestimmt, der als Haushaltsgen für Lebergewebe verwendet wurde23,33. Diese Daten wurden als Kopienzahl des Zielgens pro 10.000 Kopien des Housekeeping-Gens dargestellt. TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) wurde zur Reinigung der Gesamt-RNA aus Mauslebern verwendet. Alle Extraktionen folgten den Protokollen des Herstellers. Zur Generierung von cDNA aus RNA wurde das iScript RT-qPCR-Kit (Bio-Rad) verwendet. Unter Verwendung von iTaq SYBR Green Supermix (Bio-Rad) wurde eine Echtzeit-PCR auf einer CFX96-Echtzeitplattform (Bio-Rad) durchgeführt. Die PCR umfasste eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 Minuten, 50 Zyklen von 15 Sekunden bei 95 °C, 15 Sekunden bei 60 °C und 20 Sekunden bei 72 °C. Nach jedem Zyklus wurden Fluoreszenzmessungen bei 72 °C durchgeführt. Am Ende jeder Reaktion wurde eine Schmelzkurve (60–95 °C) überprüft, um die Identität des PCR-Produkts zu bestätigen. Die für die Expression von Sporozoitengenen verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Zur Beurteilung der Parasitämie wurden allen Mäusen durch retroorbitale Blutung 20 μl Blut entnommen. Der Prozentsatz der Parasitämie wurde durch Vergleich der GFP-positiven Erythrozyten mit der gesamten Erythrozytenzahl mittels Durchflusszytometrie (CytoFLEX, ThermoFisher) bestimmt.

Die AgTRIO-Gensequenz ohne die Region, die dem Signalpeptid entspricht, wurde in den bakteriellen Expressionsvektor pET21b (GE Healthcare)23 kloniert. Das AgTRIO-exprimierende Plasmid wird in chemisch kompetente BL21-Zellen transformiert (Thermo Fisher Scientific). Die Expression des AgTRIO-Proteins wird mit 0,1 mM IPTG bei 17 °C für 24 Stunden induziert. Die Zellen werden in PBS mit vollständig EDTA-freien Proteaseinhibitor-Tabletten (Roche) beschallt. Lösliches AgTRIO wird aus dem Überstand durch eine Kombination aus Größenbestimmung, Ionenaustausch und Affinitätschromatographie gereinigt. Die Expression von rekombinantem AgTRIO wird durch Immunoblots bestätigt, die mit dem gegen AgTRIO gezüchteten Anti-AgTRIO-Serum aus unserer vorherigen Studie23 untersucht werden. Die Proteinreinheit wird durch SDS-PAGE bestimmt und die Konzentration wird durch das BCA Protein Assay Kit (Pierce, IL) bestimmt.

Antigenspezifische Antikörperreaktionen wurden durch ELISA42,43 gemessen. Zur Herstellung des Speicheldrüsenextrakts (SGE) wurden 20 Speicheldrüsen in 100 μl PBS gesammelt und die Konzentration des SGE-Proteins betrug 0,2 mg/ml. Die 96-Well-Mikroplatten wurden über Nacht mit gereinigtem AgTRIO (1 µg/ml) oder SGE beschichtet. Nach der Blockierung mit einem Blockierungspuffer (PBS, 0,05 % Tween-20 und 1 % Rinderserumalbumin) wurden unterschiedliche Verdünnungen von Maus-Antiseren in PBS verdünnt, in die Vertiefungen gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit Waschpuffer (PBS, 0,1 % Tween-20) wurde Meerrettichperoxidase-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Invitrogen, Kat.-Nr. 62–6520) mit einer Verdünnung von 1:10.000 zum Nachweis von Gesamt-IgG verwendet. Zum Nachweis von IgG-Unterklassen wurden Meerrettichperoxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG1-, IgG2a-, IgG2b- oder IgG3-Schwerketten-Antikörper (Abcam, Kat.-Nr. ab97240, ab97245, ab97250, ab97260) mit einer Verdünnung von 1:10.000 verwendet spezifische IgG-Unterklasse.

P. berghei (ANKA GFPcon, ATCC) wurden wie zuvor beschrieben durch serielle Passage in 6–8 Wochen alten weiblichen Swiss Webster- oder C57BL/6-Mäusen gehalten23. Kurz gesagt, Swiss Webster- oder C57BL/6-Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit P. berghei-infizierten roten Blutkörperchen in Kontakt gebracht. A. gambiae-Mücken nahmen dann eine Blutmahlzeit von den infizierten Mäusen, als die Parasitämie etwa 5 % betrug. 17–24 Tage nach der Infektion mit P. berghei wurden die Mücken anhand des Fluoreszenzsignals der Speicheldrüsen sortiert.

Daten von mindestens drei biologischen Replikaten wurden zur Berechnung der Mediane für grafische Darstellungszwecke verwendet. Statistische Analysen verwendeten den Mann-Whitney-Test für nicht verwandte Gruppen und den einseitigen Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rang-Test für dieselbe Gruppe mit serieller Probenahme, um durch ELISA zu bestimmen, ob die Mückenstiche die AgTRIO-spezifischen IgGs erhöhten. Die Differenz und die Daten wurden als Median mit Interquartilbereich (IQR) dargestellt. Ein p-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Analyse, Grafiken und Statistiken aller Daten wurden mit der Prism 9.0-Software (GraphPad-Software) durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten sind in der Arbeit enthalten. Anfragen nach Ressourcen, Daten und Reagenzien sollten an den entsprechenden Autor, Dr. Y.-MC ([email protected]), gerichtet werden. Alle in dieser Studie beschriebenen einzigartigen Reagenzien sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor mit einer ausgefüllten Materialtransfervereinbarung erhältlich.

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Wir danken Kathleen DePonte und Ming-Jie Wu für ihre technische Unterstützung. Diese Studien wurden durch die Zuschüsse AI158615, AI142708 und AI145779 des National Institute of Allergy and Infectious Diseases und der Emerging Pathogens Initiative des Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Innere Medizin, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA

Yu-Min Chuang, Selma Abouneameh, Hamidah Raduwan und Erol Fikrig

Institut für RNA-Innovation und Abteilung für Medizin, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA

Mohamad-Gabriel Alameh und Drew Weissman

L2 Diagnostics, LLC, New Haven, CT, USA

Michel Ledizet

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Y.-MC und EF konzipierten und gestalteten die Studie. Y.-MC, SA und HR planten und führten Tierimmunisierungen durch, einschließlich Entblutung und Provokation zum Schutz. YM.C und SA führten ELISA-Tests durch. M.-GA und DW produzierten mRNA, produzierten leeres LNP, kapselten mRNA in LNP ein und führten eine physikalisch-chemische Charakterisierung von LNPs durch. Y.-MC, ML, DW und EF haben den Artikel mit Hilfe von Co-Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Yu-Min Chuang.

EF ist am Kapital beteiligt und fungiert als Berater für L2 Diagnostics. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chuang, YM., Alameh, MG., Abouneameh, S. et al. Ein Mücken-AgTRIO-mRNA-Impfstoff trägt zur Immunität gegen Malaria bei. npj Vaccines 8, 88 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00679-x

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Eingegangen: 20. Februar 2023

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00679-x

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