Die Wirkung von Alnus incana (L.) Moench-Extrakten bei der Linderung der Eisenüberladung

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7635 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Eisenüberladung führt zu Funktionsstörungen mehrerer Organe und zu schweren Schäden. Alnus incana aus der in Nordamerika weit verbreiteten Familie der Betulaceae wird zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt. In dieser Studie untersuchten wir die eisenchelatbildenden, antioxidativen, entzündungshemmenden und antiapoptotischen Aktivitäten des Gesamt- und Butanolextrakts aus Alnus incana bei mit Eisen überladenen Ratten und identifizierten die bioaktiven Komponenten in beiden Extrakten mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie. Wir induzierten bei den Ratten eine Eisenüberladung durch sechs intramuskuläre Injektionen von 12,5 mg Eisendextran/100 g Körpergewicht über 30 Tage. Anschließend wurden den Ratten einmal täglich 60 mg Eisensulfat/kg Körpergewicht über eine Magensonde verabreicht. Der Gesamt- und der Butanolextrakt wurden oral verabreicht und das Referenzarzneimittel (Deferoxamin) wurde einen weiteren Monat lang subkutan verabreicht. Nach zwei Monaten bewerteten wir die biochemischen, histopathologischen, histochemischen und immunhistochemischen Parameter. Eine Eisenüberladung erhöhte den Serumeisenspiegel, die Leberbiomarkeraktivitäten, den Lebereisengehalt, die Malondialdehyd-, den Tumornekrosefaktor-Alpha- und die Caspase-3-Spiegel signifikant. Es reduzierte auch den Serumalbumin-, Gesamtprotein- und Gesamtbilirubingehalt erheblich (P < 0,05) und senkte die Glutathionwerte in der Leber. Es verursachte schwere histopathologische Veränderungen im Vergleich zu den Kontrollratten, die sich nach der Behandlung deutlich (P < 0,05) besserten. Der Gesamtextrakt zeigte deutlich höhere entzündungshemmende und antiapoptotische Aktivitäten, aber geringere antioxidative und eisenchelatbildende Aktivitäten als der Butanolextrakt. Mehrere polyphenolische Verbindungen, darunter Flavonoide und Phenolsäuren, wurden durch Ultraperformance-Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie-Analyse (UPLC-ESI-QTOF-MS) nachgewiesen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Extrakte die durch Eisenüberladung verursachte Hepatoxizität und andere pathologische Zustände, die durch Eisenüberladung in der Leber gekennzeichnet sind, einschließlich Thalassämie und Sichelzellenanämie, lindern könnten.

Die Toxizität einer Eisenüberladung wurde mit erblicher Hämochromatose, Thalassämie und Lebererkrankungen, einschließlich chronischer und alkoholischer Hepatitis, in Verbindung gebracht1. Die meisten Patienten mit homozygoter β-Thalassämie leiden an einer schweren fortschreitenden Anämie, die regelmäßige lebenswichtige Bluttransfusionen erfordert, einige wenige bleiben jedoch transfusionsunabhängig2. Aufgrund chronischer Transfusionen und erhöhter gastrointestinaler Absorption reichert sich Eisen in vielen Organen und Geweben an, was zu einer fortschreitenden Funktionsstörung mehrerer Organe, einschließlich der Leber, des Herzens und der endokrinen Drüsen, führt3. Eine unerkannte Eisenüberladung kann eine Hämochromatose verursachen, bei der das in den Organen gespeicherte überschüssige Eisen schwere Gewebeschäden verursacht. Darüber hinaus kommt es in Industrieländern aufgrund des weitverbreiteten Verzehrs von rotem Fleisch und Eisenpräparaten häufig zu einer Eisenüberladung4. Ätiologisch sind die Funktionsstörungen mehrerer Organe mit dem Vorhandensein von überschüssigem freien Eisen verbunden, das den oxidativen Schaden durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)5 und den Abbau intrazellulärer Antioxidantienspiegel6 erhöht. Eisenablagerungen in den Leberzellen erhöhen das Risiko für Fibrose und Zirrhose deutlich und führen somit zu einer Erhöhung der Morbidität und Mortalität7. Darüber hinaus können die freigesetzten ROS eine Leberentzündung verursachen, indem sie spezifische proinflammatorische Mediatoren induzieren, darunter den Kernfaktor Kappa B (NF-κB) und den Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α), die zur Pathogenese und Entwicklung sowohl akuter als auch chronischer Lebererkrankungen beitragen Schäden, die in einer Zirrhose gipfeln8. Daher sollte die Eisenhomöostase aufrechterhalten werden, indem eine ausreichende Eisenversorgung aufrechterhalten und gleichzeitig eine übermäßige Eisenansammlung verhindert wird.

Die derzeit verwendeten Eisenchelatbildner wie Deferipron, Deferoxamin und Deferasirox haben mehrere unerwünschte Nebenwirkungen, darunter Agranulozytose, Leber- oder Nierenversagen, Augentoxizität, Ototoxizität und Wachstumsverzögerung9,10.

Im Vergleich zu hergestellten Medikamenten sind pflanzliche Heilmittel sicherer und haben weniger Nebenwirkungen. Darüber hinaus sind mehrere Pflanzen reich an bioaktiven Chemikalien mit starken pharmakologischen Aktivitäten11,12. Die zur Familie Betulaceae gehörende Gattung Alnus umfasst etwa 30 Baum- und Kletterpflanzenarten. Alnus incana (L.) Moench ist auf der Nordhalbkugel weit verbreitet und wird zur Behandlung von Magen-Darm- und Hauterkrankungen eingesetzt13. Es wird auch zum Gurgeln bei bakteriellen Mund- und Racheninfektionen verwendet14. Es wurde berichtet, dass diese Art natürliche Verbindungen enthält, die als Diarylheptanoide bekannt sind und unterschiedliche pharmakologische Wirkungen haben, darunter entzündungshemmende, grippehemmende und hepatoprotektive Wirkungen. Obwohl Sajid et al.15 und Kim et al.16 über die hepatoprotektive Aktivität der eng verwandten Arten Alnus nitida bzw. Alnus japonica berichteten, wurde diese Aktivität in A. incana-Extrakten noch nicht berichtet.

In jüngster Zeit untersuchen Wissenschaftler zunehmend Heilpflanzen, die reichlich natürliche chelatbildende sekundäre Pflanzenstoffe mit hohem Phenolgehalt und starker antioxidativer Aktivität enthalten, um sie zur Eisenentfernung bei Thalassämie-Patienten einzusetzen17,18. Daher untersuchte diese Studie die möglichen hepatoprotektiven, eisenchelatbildenden, antioxidativen, entzündungshemmenden und antiapoptotischen Aktivitäten des gesamten Methanolextrakts und der Butanolfraktion aus Alnus incana-Blättern auf die durch Eisenüberladung vermittelte Hepatotoxizität bei Ratten. Wir haben auch die bioaktiven Komponenten in beiden Extrakten mithilfe einer Ultraperformance-Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie-Analyse (UPLC-ESI-QTOF-MS) identifiziert.

Die phytochemische Analyse des Gesamtextrakts zeigte das Vorhandensein von Tanninen, phenolischen Verbindungen, Flavonoiden, Alkaloiden, Saponinen, Cumarinen, Terpenoiden, Anthrachinonen und β-Cyaninen (Tabelle 1).

Das Butanol und die Gesamtextrakte zeigten eine dosisabhängige Hemmung der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Aktivität mit Werten der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von 0,015 bzw. 7,55 µg/ml. Andererseits betrug der IC50-Wert in den Fraktionen Petrolether und Methylenchlorid 229 bzw. 29,06 µg/ml. Alle Konzentrationen sowohl des Gesamtextrakts als auch der Butanolfraktion hemmten die freien Radikale im Vergleich zu Methylenchlorid- und Petroletherfraktionen signifikant (P < 0,05) (Abb. 1). Daher haben wir die potenzielle Verbesserungswirkung des gesamten Alnus incana-Extrakts und der Butanolfraktion auf die durch Eisenüberladung bei männlichen Albino-Ratten hervorgerufene Hepatotoxizität untersucht.

DPPH-Fängeraktivität verschiedener A. incana-Extrakte im Vergleich zu Standard-Rutin. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von drei Experimenten ausgedrückt. aErheblich unterschiedlich zum Petrolether-Extrakt, bErheblich unterschiedlich zum Methylenchlorid-Extrakt.

Der Gesamtphenol- und Flavonoidgehalt des Gesamtextrakts betrug 125,88 ± 10,5 mg Gallussäureäquivalent (GAE)/g bzw. 122,4 ± 11,5 mg Catechinäquivalent (CE)/g, während der Gehalt der Butanolfraktion 245 ± betrug 18,5 GAE/g bzw. 100 ± 9,8 mg CE/g (Tabelle 2).

Im Gesamtextrakt und der Butanolfraktion von A. incana wurden 50 bzw. 43 Polyphenolverbindungen identifiziert, darunter Flavonoide (35, 29), Phenolsäuren (8,7), Stilbene (1, 1) und Cumarin (2, 2). bzw. Diarylheptanoide (4, 4) (Tabelle 3). Die Flavonoide umfassten Aglykone und O- oder C-Glykoside von Flavonolen, Flavonen, Isoflavonen, Flavanonen, Chalkonen und Anthocyanidinen. Stilbene, Chalkone, Anthocyanidine und Phenolsäuren stellten die Klassen mit der höchsten Konzentration (800,38 %, 247,81 %, 247,29 %, 242,39 % bzw. 101,49 %) in der Butanolfraktion im Vergleich zum Gesamtextrakt dar. Darüber hinaus waren Daidzein-8-C-glucosid, Malvidin-3-glucosid und Oregonin die Verbindungen mit der höchsten Häufigkeit in der Butanolfraktion im Vergleich zum Gesamtextrakt, der aus der Peakfläche berechnet wurde (Tabelle 3).

Zu den identifizierten Flavonoiden aus dem Gesamtextrakt und der Butanolfraktion von A. incana gehörten Quercetin, Myricetin, Baicalin, Baicalein, Apigenin, Naringenin, Puerarin und Malvidin-3-glucosid, die anhand ihrer Massenspektren durch Durchsicht der Bibliotheksdatenbank und der verfügbaren Literatur identifiziert wurden (Abbildung Ergänzung 1).

Während des gesamten Versuchszeitraums wurden bei Dosen bis zu 1000 mg/kg Körpergewicht (KG) keine Anzeichen einer akuten Toxizität und Mortalität beobachtet. Daher wurde für weitere Untersuchungen eine Dosis der Butanolfraktion von 100 mg/kg Körpergewicht gewählt.

Die mit Eisen überladene Gruppe zeigte einen erheblichen (P < 0,05) Rückgang des Albumin- und Gesamtproteinspiegels und einen deutlichen (P < 0,05) Anstieg des Gesamtbilirubinspiegels, der Aspartataminotransferase (AST) und der Alaninaminotransferase (ALT)-Aktivitäten im Vergleich zu ihre Kontrollen (Tabelle 4). Die Behandlung mit beiden Extrakten und dem Referenzarzneimittel erhöhte die Albumin- und Gesamtproteinspiegel deutlich (P < 0,05) und verringerte den Gesamtbilirubinspiegel sowie die ALT- und AST-Aktivitäten im Vergleich zu den mit Eisen überladenen Ratten signifikant (P < 0,05). Darüber hinaus zeigte der Butanolextrakt wesentlich höhere Werte der oben genannten Parameter als die mit dem Referenzarzneimittel behandelten Ratten.

Die mit Eisen überladene Gruppe wies einen deutlich höheren Eisengehalt im Serum und in der Leber auf als die Kontrollgruppe (P < 0,05). Allerdings verringerte die Verabreichung des Gesamtextrakts, der Butanolfraktion und des Deferoxamins an die mit Eisen überladenen Ratten diese Parameter im Vergleich zur überladenen Gruppe signifikant (P < 0,05). Der Serumeisenspiegel bei den mit Butanolextrakt behandelten Ratten war wesentlich niedriger als bei den mit Gesamtextrakt behandelten Ratten (P < 0,05), ohne dass es einen signifikanten Unterschied (P > 0,05) zu den Spiegeln bei den mit dem Referenzarzneimittel behandelten Ratten gab. Die Behandlung mit Butanolextrakt verringerte den Eisengehalt in der Leber im Vergleich zu denen, die mit dem Gesamtextrakt und dem Referenzarzneimittel behandelt wurden, signifikant (P < 0,05) (Abb. 2a und b).

Lebereisengehalt (a), Serumeisenspiegel (b), GSH- (c), MDA- (d), TNF-α- (e) und Caspase-3-Spiegel (f) in verschiedenen Versuchsgruppen. C: Kontrollgruppe, Eisenüberladung: Eisenüberladungsgruppe, Eisenüberladung + T: Eisenüberladung + mit Gesamtextrakt behandelte Gruppe, Eisenüberladung + B: Eisenüberladung + mit Butanolfraktion behandelte Gruppe, Eisenüberladung + D: Eisenüberladung + Deferoxamin- behandelte Gruppe. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6 Ratten/Gruppe) ausgedrückt. adeutlich verschieden von der Kontrolle, bdeutlich verschieden von der Eisenüberladungsgruppe, cdeutlich verschieden von der Eisenüberladung + B-Gruppe, ddeutlich verschieden von der Eisenüberladung + D-Gruppe.

Die Eisenverabreichung erhöhte den Gehalt an Malondialdehyd (MDA) in der Leber erheblich (P < 0,05) und reduzierte gleichzeitig den Gehalt an reduziertem Glutathion (GSH) in der Leber im Vergleich zu ihren normalen Kontrollen. Während die Behandlung mit beiden Extrakten und dem Referenzarzneimittel den MDA-Gehalt signifikant reduzierte und den GSH-Gehalt im Vergleich zu den mit Eisen behandelten Ratten erhöhte (P < 0,05). Die Reduzierung des MDA-Gehaltes war im Butanol-Extrakt deutlich höher als im Gesamtextrakt. Im Gegensatz dazu zeigte die Behandlung mit Butanolextrakt keinen signifikanten Unterschied (P > 0,05) im GSH-Spiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 2c und d).

Eine Eisenüberladung erhöhte den hepatischen TNF-α-Spiegel und die Caspase-3-Aktivität im Vergleich zu ihren Kontrollwerten signifikant (P < 0,05) (Abb. 2e und f). Umgekehrt reduzierte die Verabreichung des Gesamtextrakts, der Butanolfraktion und des Referenzarzneimittels an eisenüberladene Tiere diese Parameter im Vergleich zu den überladenen Ratten erheblich (P < 0,05). Die mit dem Gesamtextrakt behandelten Ratten zeigten einen signifikant (P < 0,05) niedrigeren TNF-α-Spiegel und eine geringere Caspase-3-Aktivität als die mit der Butanolfraktion behandelten Ratten.

Die Leberschnitte der Kontrollratten zeigten eine normale histologische Architektur. Die Leber bestand aus der Zentralvene mit regelmäßigen Leberplatten, die durch Lebersinusoide getrennt waren. Jede Leberplatte enthielt große polygonale Hepatozyten mit zentralen, abgerundeten und vesikulären Kernen (Abb. 3a). Die mit Eisen überladenen Ratten wiesen jedoch schwere Leberschäden auf, einschließlich Erweiterung und Stauung der Zentralvene und der Lebersinusoide, ungeordnete Leberstränge, hepatozelluläre Degeneration mit zytoplasmatischer Vakuolisierung, gelbbraune Eisenablagerungen, Infiltration entzündlicher Zellen zwischen Hepatozyten und im Portalbereich zusammen mit einer Erweiterung und Stauung der Pfortader (Abb. 3b–f). Im Gegensatz dazu zeigten die gemeinsam behandelten Gruppen eine deutliche Abschwächung der durch Eisenüberladung verursachten Leberschädigung. Die mit Eisen überladenen Ratten, die gleichzeitig mit dem Gesamtextrakt von Alnus incana behandelt wurden, zeigten eine bemerkenswerte Verbesserung der histologischen Struktur mit leichter Erweiterung und Stauung der Zentralvene und leichter hepatozellulärer Degeneration (Abb. 3g). Die Leberschnitte aus Gruppe IV zeigten ein scheinbar normales Leberparenchym mit nur leichter Erweiterung und Stauung der Zentralvene und leichter hepatozellulärer Degeneration (Abb. 3h). Im Gegensatz dazu stellte die gleichzeitige Verabreichung von Deferoxamin das Leberparenchym mit gerade angeordneten Lebersträngen, mäßiger Erweiterung und Stauung der Zentralvene sowie leichter hepatozellulärer Degeneration und zytoplasmatischer Vakuolisierung deutlich wieder her (Abb. 3i).

Repräsentative Mikrofotografien von Lebergewebeschnitten verschiedener Versuchsgruppen (H&E, × 400): (a) Kontrollgruppe mit normaler histologischer Architektur des Lebergewebes mit Zentralvene (CV) und regelmäßigen Leberplatten (Pfeil), getrennt durch Lebersinusoide (Pfeilspitze) ( b:f) Eisenüberladene Gruppe mit schwerer Leberschädigung, einschließlich Erweiterung und Stauung der Zentralvene (Stern) und der Lebersinusoide (weiße Pfeilspitze), ungeordneter Leberstränge, hepatozellulärer Degeneration mit zytoplasmatischer Vakuolisierung (weißer Pfeil), gelb-braunen Eisenablagerungen (gelber Pfeil), Infiltration von Entzündungszellen zwischen Hepatozyten (Kreis) und im Pfortaderbereich (gelbe Pfeilspitze) zusammen mit Erweiterung und Stauung der Pfortader (PV). (g:i) Gemeinsam behandelte Gruppen (III, IV und V), die eine deutliche Abschwächung der durch Eisenüberladung verursachten Leberschädigung zeigten, begleitet von einer Abnahme der Eisenansammlung (gelber Pfeil). (g) Mit Eisen überladene Gruppe, die gleichzeitig mit dem Gesamtextrakt von Alnus incana behandelt wurde und eine bemerkenswerte Verbesserung der histologischen Struktur mit leichter Erweiterung und Stauung der Zentralvene (Stern) und leichter hepatozellulärer Degeneration (weißer Pfeil) zeigte. (h) Eisenüberladene Gruppe, die gleichzeitig mit Butanolextrakt von Alnus incana behandelt wurde und ein scheinbar normales Leberparenchym mit nur leichter Erweiterung und Stauung der Zentralvene (Stern) und leichter hepatozellulärer Degeneration (weißer Pfeil) zeigte. (i) Die mit Eisen überladene Gruppe, die gleichzeitig mit Deferoxamin behandelt wurde, stellte das Leberparenchym mit gerade angeordneten Lebersträngen (Pfeilspitze), mäßiger Erweiterung und Stauung der Zentralvene (Stern) sowie leichter hepatozellulärer Degeneration und zytoplasmatischer Vakuolisierung (weißer Pfeil) deutlich wieder her.

Unsere Ergebnisse (Tabelle 5) zeigten, dass der höchste histopathologische Läsionswert in der eisenüberladenen Gruppe (II) beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu zeigten die gemeinsam behandelten Gruppen (III, IV und V) eine deutliche Verringerung aller mikroskopischen Läsionswerte.

Um die Verteilung der Eisenablagerungen in den Lebergewebeschnitten sichtbar zu machen und die Variation zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen zu bestätigen, wurde eine Prussian-Färbung durchgeführt. Die Leberschnitte der Kontrollgruppe zeigten keine Eisenablagerungen (Abb. 4a). Umgekehrt repräsentierte das blaue Pigment die Eisenablagerungen im Zytoplasma der Hepatozyten, im Interstitium und im Portalbereich in den anderen behandelten Gruppen (Abb. 4b – m). Die höchste Eisenanreicherung in der Leber wurde bei den mit Eisen überladenen Ratten beobachtet (Abb. 4b – d) mit einem mittleren Flächenprozentsatz (33, 92 ± 0, 57, Abb. 4n) im Vergleich zu anderen gleichzeitig behandelten Gruppen (Abb. 4e – m). Während die Behandlung mit Gesamtextrakt (Abb. 4e–g) und Butanolextrakt (Abb. 4h–j) sowie Deferoxamin (Abb. 4k–m) die Eisenansammlung in der Leber mit einem mittleren Flächenprozentsatz (21,25 ± 0,78) deutlich (P < 0,05) schwächte , 18,33 ± 0,59 bzw. 22,59 ± 0,47, Abb. 4n).

Mikrofotografien, die die Verteilung (a–m) und Quantifizierung (n) von mit Berliner Blau gefärbten Eisenablagerungen in den Lebergewebeschnitten verschiedener Gruppen darstellen. (a) Kontrollgruppe, (b:d) Gruppe mit Eisenüberladung, (e:g) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit Gesamtextrakt von Alnus incana behandelt, (h:j) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit butanolischem Extrakt behandelt und (k :m) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit Deferoxamin behandelt. (a,b,e,h,k: × 100) (c,f,i,l: Starke Vergrößerung des zentralen Bereichs, × 400) (d,g,j,m: Starke Vergrößerung des Portalbereichs, × 400). (n) Quantifizierung des Anteils der mit Berliner Blaufärbung positiven Fläche im Lebergewebe von Ratten. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

Die Leberschnitte aus der mit Eisen überladenen Gruppe (Abb. 5b) zeigten eine stärkere positive Immunreaktivität für Caspase 3 als die Kontrollgruppe (Abb. 5a). Während die mit Eisen überladene Gruppe, die gleichzeitig mit dem Gesamtextrakt, der Butanolfraktion oder Deferoxamin behandelt wurde, im Vergleich zu Gruppe II eine moderate Caspase-3-Immunreaktivität aufwies (jeweils Abb. 5c–e).

Mikrofotografien von mit Caspase 3 gefärbten Leberschnitten von Ratten in den verschiedenen Versuchsgruppen (× 400). (a) Kontrollgruppe, (b) Gruppe mit Eisenüberladung, (c) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit Gesamtextrakt von Alnus incana behandelt, (d) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit Butanol behandelt, und (e) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig behandelt mit Deferoxamin behandelt.

Die Leberschnitte aus der mit Eisen überladenen Gruppe (Abb. 6b) zeigten eine höhere positive Immunreaktivität für NF-κB als die Kontrollgruppe (Abb. 6a). Umgekehrt zeigte die mit Eisen überladene Gruppe, die gleichzeitig mit Gesamtextrakt (Gruppe III), Butanolfraktion (Gruppe IV) oder Deferoxamin (Gruppe V) behandelt wurde, eine mildere NF-κB-Immunreaktivität als Gruppe II (jeweils Abb. 6c–e).

Mikrofotografien von NFκB-gefärbten Leberschnitten von Ratten in den verschiedenen Versuchsgruppen (× 400). (a) Kontrollgruppe, (b) Gruppe mit Eisenüberladung, (c) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit Gesamtextrakt von Alnus incana behandelt, (d) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig mit Butanol behandelt, und (e) Gruppe mit Eisenüberladung, gleichzeitig behandelt mit Deferoxamin behandelt.

Die aktuellen Ergebnisse zeigten, dass der hepatische Eisenspiegel signifikant mit hepatischem TNF-α, Caspase-3, MDA, Serumeisenspiegel, ALT, AST und Gesamtbilirubinspiegel korrelierte, wobei r = 0,813**, 0,833**, 0,798** , 0,823**, 0,845**, 0,813** bzw. 0,910**. Andererseits wurde eine signifikante negative Korrelation zwischen dem Eisengehalt in der Leber und dem GSH-Gehalt in der Leber, Serumalbumin und Gesamtserumprotein beobachtet, wobei r = − 0,798** − 0,87** bzw. − 0,869** (**P < 0,01). In ähnlicher Weise korrelierte der Serumeisenspiegel signifikant mit dem hepatischen TNF-α-, Caspase-3-, MDA-, ALT-, AST- und Gesamtbilirubinspiegel, wobei r = 0,791**, 0,750**, 0,933**, 0,792**, 0,786* * bzw. 0,865**. Außerdem korrelierte der Serumeisenspiegel negativ mit hepatischem GSH, Serumalbumin und Gesamtprotein, wobei r = − 0,798**, − 0,830** und − 0,779** (**P < 0,01).

Eisen, ein essentielles Mikroelement, spielt in lebenden Organismen mehrere wichtige Rollen19,20. Eine Eisenüberladung aufgrund von Vergiftungen, Krankheiten und pathologischen Zuständen kann jedoch zu Funktionsstörungen mehrerer Organe, einschließlich Leberschäden, führen21. Die derzeit verwendeten Eisenchelatoren wie Deferipron, Deferoxamin und Deferasirox verursachen mehrere unerwünschte Nebenwirkungen, darunter Agranulozytose, Neutropenie, Magen-Darm-Störungen und Leber- oder Nierenversagen9,10. Diese Nachteile der aktuellen Eisenchelatbildner verdeutlichen die Innovation für alternative und sichere pharmakologische Interventionen. Ebrahimzadeh et al.18 zeigten, dass Kräuterextrakte mit hohem Phenolgehalt als Chelatoren oder Adjuvantien zur Behandlung einer Eisenüberladung wirken können. Daher haben wir hier die antioxidativen, eisenchelatbildenden, entzündungshemmenden und antiapoptotischen Potenziale des Methanolextrakts aus Alnus incana-Blättern und seiner Butanolfraktion gegen durch Eisenüberladung verursachte Hepatotoxizität untersucht.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine übermäßige Eisenaufnahme den Eisenspiegel im Serum und in der Leber erhöhte, begleitet von erheblichen Veränderungen der Leberfunktion und der Lipidperoxidation. Dies führte in der Folge zu einem Mangel an antioxidativen Abwehrmechanismen und zur Apoptose des Lebergewebes. Diese Ergebnisse stimmen mit Badria et al.22 und Al-Basher23 überein.

Basierend auf unseren Ergebnissen zeigten mit Eisen überladene Ratten signifikant erhöhte ALT- und AST-Enzymaktivitäten im Serum und Gesamtbilirubinspiegel, aber niedrigere Serumalbumin- und Gesamtproteinwerte, was mit Al-Basher23 übereinstimmt. Darüber hinaus korrelierte der Eisengehalt in der Leber signifikant mit dem ALT-, AST- und Gesamtbilirubinspiegel im Leberserum, wobei r = 0,845**, 0,813** bzw. 0,910** (**P < 0,01). Während der Eisengehalt in der Leber negativ mit Serumalbumin und Gesamtserumprotein korrelierte, wobei r = − 0,87** bzw. − 0,869** (**P < 0,01). Diese Ergebnisse gingen mit einem signifikanten Anstieg des mittleren Flächenprozentsatzes (33,92 ± 0,57) der Eisenansammlung in der Leber sowie mit schweren histopathologischen Veränderungen in Form von Dilatation und Verstopfung der Zentralvene und Lebersinusoiden, ungeordneten Lebersträngen und hepatozellulärer Degeneration einher Zytoplasmatische Vakuolisierung und Infiltration von Entzündungszellen. Diese Ergebnisse stimmen mit Jahanshahi et al.24 und Wang et al.25 überein. Die erhebliche Erhöhung der Leberfunktion weist auf eine Leberschädigung hin, die anschließend die Transportfunktion der Hepatozyten beeinträchtigt, und auf eine Leckage, die zur Freisetzung von ALT und AST führt26,27. Darüber hinaus können diese histopathologischen Veränderungen die Leberfunktionen beeinträchtigen und Hypalbuminämie und Hypoproteinämie hervorrufen. Darüber hinaus führt ein übermäßiger Eisengehalt zu einer erheblichen Funktionsstörung der Hepatozyten, was zu einem Versagen der normalen Aufnahme, Konjugation und Ausscheidung und einem anschließenden Anstieg des Gesamtbilirubinspiegels führt28.

Allerdings reduzierte die Verabreichung beider Extrakte im Vergleich zu den mit Eisen überladenen Ratten die Werte der AST-, ALT-Aktivitäten und des Gesamtbilirubins deutlich und erhöhte die Albumin- und Gesamtproteinspiegel. In der mit Butanolextrakt behandelten Gruppe wurden die Parameter wieder in ihren normalen Bereich gebracht, begleitet von einer deutlichen Verringerung des mittleren Flächenprozentsatzes der Eisenablagerungen in der Leber und einer deutlich verbesserten Leberparenchymstruktur. Diese Ergebnisse legen die starke antioxidative Wirkung beider Extrakte nahe, wie durch die Messung der Aktivität zum Abfangen freier Radikale belegt (Abb. 1). Diese antioxidative Wirkung könnte auf das Vorhandensein von Flavonoiden und Polyphenolen in diesen Extrakten zurückzuführen sein, die die Integrität der Leberzellmembran stabilisieren und aufrechterhalten, die Hepatozytenregeneration stimulieren, das geschädigte Gewebe schwächen und reparieren und anschließend die enzymatische Aktivität der Leber steigern können und Synthese hepatozellulärer Proteine29,30. Darüber hinaus verringerte die Verabreichung von Butanol den Eisengehalt in der Leber im Vergleich zu den mit dem Gesamtextrakt und dem Referenzarzneimittel behandelten Tieren erheblich, was darauf hindeutet, dass es bei den mit Eisen überladenen Ratten eine bessere Eisenchelatbildungsaktivität als der Gesamtextrakt aufweist.

Die phytochemischen Profile des Gesamtextrakts und der Butanolfraktion von A. incana wurden mithilfe der UPLC-ESI-QTOF-MS-Analyse identifiziert. Die Daten zeigten, dass der Gesamtextrakt und die Butanolfraktion reich an verschiedenen Polyphenolen und Diarylheptanoiden waren.

Die höchste eisenchelatbildende Aktivität der Butanolfraktion könnte auf die größere Häufigkeit von Daidzein-8-C-glucosid, Malvidin-3-glucosid und Oregonin in dieser Fraktion als im Gesamtextrakt zurückgeführt werden (Tabelle 3). Es wurde berichtet, dass die oben genannten Verbindungen über verschiedene Wirkmechanismen eine eisenchelatbildende Wirkung zeigten31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. Darüber hinaus sind Flavonoide die wichtigste identifizierte Klasse von Bestandteilen in A. incana-Extrakten und können Metalle effizienter chelatisieren als andere Polyphenole, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise zur Behandlung einer Eisenüberladung eingesetzt werden können. Laut Wang et al.42 bekämpfen Flavonoide die Ansammlung von Eisen durch drei Hauptmechanismen: (1) Verringerung der Eisensättigung indirekt über mehrere Proteine und Wege, wie Ferritin und Hepcidin; (2) Chelatisierung von Eisen, um die Eisenanreicherung zu verringern, wodurch die Eisensättigung über Bindungsstellen wie die 6,7-Dihydroxystruktur, das B-Ring-Brenzcatechin und die 2,3-Doppelbindung direkt verringert wird. Es wurde auch berichtet, dass Baicalin, Baicalein und Quercetin eine signifikante Eisenchelatisierungsaktivität aufweisen; (3) Oxidationsbeständigkeit zur Verringerung oxidativer Schäden durch Eisenüberladung durch Reaktion mit Superoxid-Anionenradikalen zur Verhinderung der Entstehung freier Radikale, Unterdrückung der Fenton-Reaktion zur Verhinderung der Bildung von Hydroxylradikalen und Reaktion mit Lipidperoxidationsgruppen zur Verhinderung der Lipidperoxidation. Dieser Effekt kann auf höhere Mengen an Polyphenolen im Butanolextrakt als im Gesamtextrakt zurückzuführen sein (Tabelle 2). Polyphenole üben ihre antioxidative Wirkung über verschiedene Mechanismen aus, darunter das Abfangen freier Radikale und die Eisenbindung. Im Allgemeinen fördern Übergangsmetalle, an denen Eisen beteiligt ist, die Produktion von freien Sauerstoffradikalen, reduzieren Peroxid und interagieren mit Superoxidanionen, was zu oxidativem Stress führt. Es wurde festgestellt, dass Polyphenole eisenbindende Fähigkeiten besitzen; Diese Aktivitäten sind hauptsächlich auf das Vorhandensein von Gruppen wie Catechol und Galloyl zurückzuführen. Darüber hinaus ergaben einige Untersuchungen, dass die 6,7-Dihydroxystruktur, B-Ring-Brenzcatechin, die Galloylgruppen, die 2,3-Doppelbindung und die 3- und 5-Hydroxylgruppen gemeinsam mit der 4-Ketogruppe vorhanden sind sind mit Chelatbildungsfähigkeiten verbunden und kommen daher als Eisenbindungsstellen in Betracht42.

In dieser Studie führte ein übermäßiger Eisengehalt in der Leber zu einem erheblichen (P ˂ 0,05) Anstieg des MDA-Gehalts in der Leber sowie zu einem deutlichen (P ˂ 0,05) Rückgang des GSH-Spiegels in der Leber in den eisenüberladenen Gruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Diese Ergebnisse deuten auf oxidativen Stress durch verstärkte Lipidperoxidation, übermäßige Bildung freier Radikale und einen mangelhaften antioxidativen Mechanismus hin, der anschließend zu Leberfunktionsstörungen und dem Verlust von Leberenzymen führt43,44. Papanikolaou und Pantopoulos45 zeigten, dass überschüssiges Eisen freie Radikale erzeugt, die Schäden an zellulären Makromolekülen hervorrufen und den Zelltod verstärken. Unsere Ergebnisse deuten auf eine signifikante Korrelation zwischen dem Eisengehalt in der Leber und dem MDA-Spiegel (r = 0,798**) und eine negative Korrelation zwischen dem Eisengehalt in der Leber und dem GSH-Gehalt (r = − 0,798**) hin. Umgekehrt schwächte die Behandlung mit Gesamtextrakt und Butanol-Fraktion den induzierten oxidativen Stress ab, was durch einen deutlichen (P ˂ 0,05) Anstieg des GSH-Gehalts und einen signifikanten (P ˂ 0,05) Rückgang des MDA-Spiegels im Vergleich zu den mit Eisen überladenen Ratten belegt wurde. Diese Ergebnisse könnten auf die in beiden Extrakten enthaltenen Antioxidantien zurückzuführen sein. Der Butanol-Extrakt zeigte eine stärkere antioxidative Wirkung als der Gesamtextrakt. Da diese Fraktion einen höheren Polyphenolgehalt (245 mg GAE/g) enthält als der Gesamtextrakt (126 mg GAE/g, Tabelle 2), korreliert die antioxidative Aktivität mit der Polyphenolkonzentration46. Natürliche Polyphenole sind wirksame Antioxidantien, da sie freie Radikale abfangen, Metalle chelatisieren, primäre Oxidationsprodukte in nichtradikale Moleküle umwandeln, die Kette unterbrechen können, um den kontinuierlichen Verlust von Wasserstoff aus Substraten zu verhindern, und antioxidative Enzyme regulieren47.

Unsere Studie bestätigte, dass sich die durch Eisenüberladung induzierte Apoptose in einer starken Caspase-3-Immunreaktivität mit deutlich (P ˂ 0,05) erhöhter Leber-Caspase-3-Aktivität manifestierte. Dies korrelierte im Wesentlichen mit dem Eisengehalt in der Leber. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass überschüssiges Eisen oxidativen Stress verursacht, der wiederum Schäden an der inneren Mitochondrienmembran verursacht und die Öffnung der Mitochondrienporen initiiert. Dadurch wird Adenosintriphosphat (ATP) erschöpft und Cytochrom C wird in das Zytosol freigesetzt, das anschließend Caspase 3 aktiviert und den Zelltod induziert8,48. Die Aktivierung von Caspase 3, einem entscheidenden Apoptosemediator, führt zu einer DNA-Fragmentierung und einer apoptotischen Chromatinkondensation in den Zellen49. Daher fördert überschüssiges Eisen entweder allein oder in Kombination mit oxidativem Stress die Nekrose oder Apoptose von Leberzellen48. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass Entzündungen ein weiterer möglicher Mechanismus der durch Eisenüberladung verursachten Hepatotoxizität sind, da die Eisenüberladungsgruppe eine signifikant (P ˂ 0,05) höhere TNF-α-Aktivität in der Leber aufwies, begleitet von einer starken immunhistochemischen NF-κB-Expression. Handa et al.50 berichteten, dass eine übermäßige Eisenergänzung oxidativen Stress in den Leberzellen auslöst und sowohl Entzündungs- als auch Immunmediatoren sowie hepatozelluläre Ballonschäden auslöst, was zur Prognose einer nichtalkoholischen Steatohepatitis führt. TNF-α, ein multifunktionales Zytokin, ist entscheidend für verschiedene physiologische und pathologische Mechanismen, einschließlich Entzündung, Apoptose und Nekrose51. Darüber hinaus aktiviert TNF-α die NF-κB-Signalwege durch die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren, was zu einer erhöhten immunhistochemischen Expression von NF-κB52,53 führt. Die Aktivierung von NF-κB kann die Expression einer Reihe von entzündlichen Zytokinen, die an Entzündungen beteiligt sind, initiieren und regulieren54,55. Darüber hinaus wird NF-κB durch die übermäßige Bildung von ROS und vielen Zytokinen, einschließlich Interleukin-1 beta56, reguliert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass beide Extrakte starke entzündungshemmende und antiapoptotische Aktivitäten aufweisen, die sich in einer milden NF-κB-Immunreaktivität, einer moderaten Caspase-3-Immunexpression mit deutlich (P ˂ 0,05) geringeren TNF-α- und Caspase-3-Aktivitäten in der Leber als in der mit Eisen überladenen Gruppe manifestieren. Dies könnte auf die starke antioxidative Wirkung dieser Extrakte zurückzuführen sein, zusammen mit ihrer Fähigkeit, den Eisengehalt in der Leber zu chelatisieren und zu hemmen. Darüber hinaus zeigte der Gesamtextrakt höhere entzündungshemmende und antiapoptotische Aktivitäten als der Butanolextrakt, möglicherweise aufgrund der synergistischen Wirkung mehrerer Polyphenolverbindungen, darunter Phenolsäuren, Flavonoide, Stilbene, Cumarine, Lignine und Tannine, die entzündungshemmende und antiapoptotische Wirkungen haben antiapoptotische Aktivitäten57,58,59,60,61,62. Darüber hinaus wurden in diesem Extrakt auch andere Klassen, nämlich Saponine, Terpenoide, Anthrachinone und Diarylheptanoide, mit ähnlichen Aktivitäten63,64,65,66 nachgewiesen (Tabelle 1).

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung mit Deferoxamin den Eisengehalt im Serum und in der Leber sowie die Leberbiomarker (AST und ALT) signifikant senkt, was im Einklang mit Mansi et al.20, Jahanshahi et al.24 und Wang et al.25 steht. Darüber hinaus reduzierte diese Behandlung die erhöhten MDA-, TNF-α- und Caspase-3-Spiegel sowie den GSH-Gehalt deutlich, was im Einklang mit Wang et al.25 steht. Darüber hinaus schwächte Deferoxamin die Eisenablagerung in der Leber deutlich ab, verbesserte die Leberschädigung und verringerte die durch die Eisenüberladung induzierte Caspase-3- und NF-κB-Immunreaktivität, was mit den Beobachtungen von Jahanshahi et al.24 und Wang et al.25 übereinstimmt. Diese Ergebnisse werden auf seine starke chelatbildende Wirkung zurückgeführt. Heli et al.67 berichteten, dass Eisenchelatbildner oxidativen Stress verringern könnten, indem sie überschüssiges Eisen aus den Zielgeweben entfernen.

Unsere Studie hat gezeigt, dass sowohl Gesamt- als auch Butanolextrakte aus Alnus incana überschüssiges Eisen deutlich chelatisieren und die durch Eisenüberladung verursachte Hepatotoxizität bei Ratten lindern können, indem sie den Eisengehalt im Serum und in der Leber sowie die Aktivitäten von Leberbiomarkern reduzieren, oxidativen Stress verringern, Entzündungen und Apoptose hemmen, was zu … deutlich höherer Serumalbumin-, Gesamtprotein- und Gesamtbilirubingehalt sowie verbesserte endogene antioxidative Aktivität. Darüber hinaus können sie aufgrund ihrer phytochemischen Inhaltsstoffe die durch Eisenüberladung verursachten histopathologischen und histochemischen Veränderungen lindern. Diese Ergebnisse legen nahe, dass beide Extrakte eine neuartige Behandlung für durch Eisenüberladung verursachte Hepatoxizität und andere pathologische Zustände darstellen könnten, die durch Eisenüberladung in der Leber gekennzeichnet sind, einschließlich Thalassämie und Sichelzellenanämie.

Alle Chemikalien waren von hoher analytischer Qualität und wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Deferoxamin wurde von Novartis Pharma AG (Basel, Schweiz) bezogen.

Die Blätter von Alnus incana (L.) Moench wurden mit Genehmigung des Forschungsgartens Al Zoharia gemäß institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien gesammelt. Dr. Mamdouh Shokry, ein Botaniker am Al Zoharia Research Garden in Kairo, Ägypten, validierte und authentifizierte das Pflanzenmaterial. Ein Belegexemplar wurde im Herbarium des Pharmacognosy Lab, Fakultät für Pharmazie (Mädchen), Al-Azhar-Universität unter der Nummer (AR-2016) hinterlegt.

Das luftgetrocknete Pflanzenmaterial (1 kg) wurde durch gründliches Mazerieren mit 100 % Methanol (3x, 3 l) extrahiert und durch Filterpapier (Whatman Nr. 1) filtriert. Das gesammelte Filtrat wurde unter Vakuum (45 °C) am Rotationsverdampfer getrocknet, um den Gesamtextrakt zu erhalten. Dann wurden 350 g des Gesamtextrakts in destilliertem Wasser suspendiert und dann nacheinander unter Verwendung von Lösungsmitteln mit Gradientenpolarität, einschließlich Petrolether, Methylenchlorid und n-Butanol, fraktioniert. Die Fraktionen wurden filtriert und mit einem Rotationsverdampfer bei geeigneter Temperatur eingedampft, um die Fraktionen Petrolether (60 g), Methylenchlorid (220 g) und n-Butanol (12 g) zu erhalten.

Wir haben qualitative Tests durchgeführt, um die verschiedenen phytochemischen Klassen in den Gesamt- und Butanolextrakten aus Alnus incana-Blättern nachzuweisen68.

Der Gesamtphenolgehalt wurde nach dem Folin-Ciocalteu-Verfahren69 bestimmt. Der Gesamtgehalt an Flavonoiden wurde anhand des staatlichen Arzneibuchs der UdSSR70 quantifiziert.

UPLC-ESI-QTOF-MS ist eine hochentwickelte und empfindliche Technik zur qualitativen und quantitativen Identifizierung sekundärer Pflanzenmetaboliten. Eine negative ESI-Technik wurde angewendet, um die verschiedenen Phytobestandteile im Gesamtextrakt und der Butanolfraktion von A. incana nachzuweisen.

Der Gesamtextrakt und die Butanolfraktion von A. incana (100 mg) wurden in 2 ml Methanol: Acetonitril: Wasser (1:1:2) durch 2-minütiges Vortexen und 10-minütige Ultraschallbehandlung gelöst. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 10.000 U/min wurde die Lösung verdünnt, um eine Endkonzentration von 2,5 µg/µL zu erreichen. Anschließend wurden 10 µL für die Injektion im Negativmodus verwendet. Die Moleküle wurden unter Verwendung eines Axion AC-Systems (Kyoto, Japan) getrennt, das mit einem Autosampler-System mit einer In-Line-Filterscheiben-Vorsäule (0,5 µm × 3 mm, Phenomenex, USA) und einer Xbridge C18 (3,5 µm × 2,1 mm × 50 mm) verbunden war mm) Säule (Waters Corporation, Milford, MA, USA), gehalten bei 40 °C und einer Flussrate von 300 μl/min. Die Gradientenelution erfolgte unter Verwendung der mobilen Phase, die aus 5 mM Ammoniumformiat in 1 % Methanol (pH = 8) und 100 % Acetonitril besteht. Für die MS-Analyse wurde das Triple TOF™ 5600+-System verwendet, das mit einer Duo Spray™-Quelle ausgestattet ist, die im ESI-Modus arbeitet (AB SCIEX, Concord, Kanada). Nach jedem Scan wurden die 15 intensivsten Ionen zur Aufnahme der MS/MS-Fragmentierungsspektren ausgewählt. Die Zielanalyten wurden erkannt, indem die LC/MS-Daten mit der Referenzdatenbank (ReSpect negativ, 1573 Datensätze) und zuvor veröffentlichten Verbindungen in Beziehung gesetzt wurden71.

Das Radikalfängerpotenzial der Extrakte wurde mit der von72 beschriebenen Methode bewertet. IC50 für alle Extrakte wurde durch Probit-Analyse73 bestimmt.

Sechzig männliche Wistar-Ratten (210–230 g) wurden aus dem Tierhaus der National Organization for Drug Control and Research bezogen. Sie wurden unter Standardumgebungsbedingungen gehalten, einschließlich eines regelmäßigen Hell-Dunkel-Zyklus (12/12 Stunden), 25 °C ± 1 °C Raumtemperatur und 50 % ± 4 % relativer Luftfeuchtigkeit. Nachdem sie sich eine Woche lang unter einem natürlichen Lichtzyklus und ausreichender Belüftung akklimatisiert hatten, erhielten sie eine Standard-Pellet-Diät und hatten uneingeschränkten Zugang zu Wasser.

Dreißig Ratten wurden zu gleichen Teilen fünf Gruppen zugeteilt (6 Ratten/Gruppe). Allen Gruppen wurden steigende Dosen (125, 250, 500 und 1000 mg/kg Körpergewicht) der Butanolfraktion oral verabreicht. Die Gruppe, der nur das Vehikel verabreicht wurde, diente als normale Kontrolle. Nach einer Stunde wurden die Ratten einzeln auf abnormale Verhaltensänderungen wie Schläfrigkeit, Ruhelosigkeit, Krämpfe, Krämpfe und andere Symptome von Toxizität und Mortalität beobachtet. Anschließend wurden sie 14 Tage lang alle 24 Stunden intermittierend auf akute Toxizitätssymptome überwacht74.

Alle Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Kairo genehmigt (Genehmigungsnummer: Vet Cu 2009 2022484) und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health. Alle Methoden wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Dreißig Ratten wurden zu gleichen Teilen fünf Gruppen (6 Ratten/Gruppe) wie folgt zugeordnet:

Die Ratten der Kontrollgruppe wurden mit destilliertem Wasser versorgt.

Ratten der mit Eisen überladenen Gruppe erhielten 30 Tage lang gleichmäßig sechs intramuskuläre Injektionen von 12,5 mg Eisendextran/100 g Körpergewicht. In der Zwischenzeit wurden den Ratten einmal täglich 60 mg Eisensulfat/kg Körpergewicht über eine Magensonde verabreicht.

Eisenüberladene Ratten + Gesamtextrakt der Alnus incana-Gruppe Eisenüberladene Ratten erhielten den methanolischen Extrakt (200 mg/kg Körpergewicht) gemäß Sajid et al.15 einen Monat lang einmal täglich oral über eine Magensonde.

Gruppe mit Eisenüberladung + Butanolfraktion Eisenüberladene Ratten erhielten einen Monat lang einmal täglich über eine Magensonde oral eine Butanolfraktion (100 mg/kg Körpergewicht).

Eisenüberladene Gruppe + Referenzarzneimittel (Deferoxamin) Eisenüberladene Ratten, denen Deferoxamin (50 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert wurde, gemäß Mirzaei et al.75, einmal täglich über einen Monat.

Nach zwei Monaten wurden von allen Gruppen durch retroorbitale Plexuspunktion Blutproben entnommen, 15 Minuten lang aufbewahrt und 15 Minuten lang zentrifugiert, um das Serum abzutrennen, das zur Beurteilung der biochemischen Parameter verwendet wurde. Danach wurden die Ratten durch Genickbruch eingeschläfert und ihre Lebern entweder für biochemische Untersuchungen gelagert oder zur weiteren histopathologischen Untersuchung in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) fixiert.

Serumalbumin-, Gesamtprotein-, Gesamtbilirubin-, AST- und ALT-Aktivitäten wurden anhand kommerzieller Kits bewertet, die von Biodiagnostics, Kairo, Ägypten, erworben wurden.

Der Serumeisenspiegel wurde mithilfe eines kommerziellen Kits geschätzt, das von Spectrum Diagnostics, Kairo, Ägypten, erworben wurde. Lebergewebeproben wurden in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung homogenisiert, dann wurde der Lebereisengehalt in den Homogenaten wie von Wootton76 beschrieben bestimmt.

Die Leberhomogenate wurden verwendet, um MDA (ein Lipidperoxidations-Biomarker), GSH und die Gesamtproteinkonzentration auf der Grundlage der von Ohkawa et al.77, Ellman78 bzw. Bradford79 beschriebenen Methoden abzuschätzen.

Wir haben die Caspase-3-Aktivität und den TNF-α-Spiegel im Leberhomogenat mithilfe von ELISA-Kits untersucht, die von Cusabio, Deutschland, gekauft wurden.

Die Lebergewebeproben wurden in 10 % NBF fixiert, in Alkohol und Xylol verarbeitet, in Paraffin eingebettet, mit einem manuellen Mikrotom in 4 µm dicke Schnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, wie zuvor von Bancroft und Gamble80 berichtet . Wir haben die Eisenablagerung und -verteilung mithilfe der Preußischblau-Färbung nach Sheehan und Hrapchak81 nachgewiesen. Die gefärbten Abschnitte wurden mit einer feststehenden Olympus-Kamera untersucht und fotografiert.

Die Bewertung der Leberläsionen wurde in allen Gruppen (6 Ratten/Gruppe) blind ausgewertet und der Schweregrad der pathologischen Läsionen wurde wie folgt gemessen: keine (−, normale Struktur), leichte Veränderungen (+, < 25 %), mäßige Veränderungen ( ++, 25–50 %, schwere Veränderungen (+++, 51–75 %) und sehr schwere Veränderungen (++++, > 75 %)44.

Für die Bildanalyse wurden fünf verschiedene preußisch blau gefärbte Schnitte (×100) aus jeder Gruppe untersucht und der Flächenanteil (Flächen-%) der preußisch blau gefärbten Eisenablagerungen, dargestellt durch die blaue Pigmentierung, mithilfe des ImageJ-Programms quantifiziert.

Leberproben aller Versuchsgruppen wurden einer Immunhistochemie (IHC) unter Verwendung von Caspase 3- und NF-κB-Antikörpern unterzogen. Die Paraffinschnitte wurden auf Klebeobjektträgern fixiert, rehydriert, einer Antigengewinnung durch Erhitzen unterzogen, dann gewaschen und mit primären polyklonalen Antikörpern gegen Caspase 3/CPP32 (aktive Form, Diagnostic BioSystems) und NFκB-p65 (Elabscience Biotechnology) in einer Verdünnung von inkubiert 1:100 über Nacht, gefolgt von Waschen und Inkubation mit Meerrettichperoxidase für 2 Stunden. Nach zwei Wäschen wurde ein Diaminobenzidin-Kit zur Entwicklung der Immunfärbung verwendet, und die braune Farbe stellte eine positive Immunreaktivität dar.

Die erhaltenen Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. In der statistischen Analyse wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest unter Verwendung von SPSS Version 21.0. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Der Korrelationskoeffizient wurde mithilfe der linearen Regression nach Abdel-Daim et al.82 geschätzt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB). Diese Forschung erhielt keine spezifische Förderung von einer Förderagentur im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Abteilung für Pharmakognosie und Heilpflanzen, Fakultät für Mädchenpharmazie, Al Azhar-Universität, Kairo, Ägypten

Fatma Abo-Elghiet, Shaza A. Mohamed und Abeer Temraz

Abteilung für Zytologie und Histologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Kairo, Gizeh, Ägypten

Obwohl AE Yasin

Nationale Organisation für Drogenkontrolle und -forschung, Dokki, Kairo, Ägypten

Walid Hamdy El-Tantawy und Samah Fathy Ahmed

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WHT schlug die Konzeption für die Studie vor; entwarf die Experimente; durchgeführte statistische Analyse; FA führte die phytochemische Untersuchung und Interpretation der phytochemischen Daten durch und schrieb die Arbeit, und SAM führte die phytochemische Untersuchung und Interpretation der phytochemischen Daten durch, SFA führte die Forschung und biochemischen Studien durch, AT führte die Datenanalyse und die endgültige Überarbeitung durch, YNAE führte durch führte die histopathologischen, histochemischen und immunhistochemischen Studien durch und verfasste das Manuskript. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen, überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Noha AE Yasin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Abo-Elghiet, F., Mohamed, SA, Yasin, NAE et al. Die Wirkung von Alnus incana (L.) Moench-Extrakten bei der Linderung der durch Eisenüberladung verursachten Hepatotoxizität bei männlichen Albino-Ratten. Sci Rep 13, 7635 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34480-6

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Eingegangen: 14. Dezember 2022

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 11. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34480-6

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