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Das ISME Journal (2023)Zitieren Sie diesen Artikel

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Die Multi-Omics-Analyse ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Erkennung und Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Königreichen, beispielsweise zwischen bakteriellen und archaischen Mitgliedern komplexer biogasproduzierender mikrobieller Gemeinschaften. In der vorliegenden Studie wurden die Mikrobiome von drei Biogasanlagen im industriellen Maßstab, die jeweils mit unterschiedlichen Substraten gefüttert wurden, mithilfe eines durch maschinelles Lernen gesteuerten genomzentrierten Metagenomik-Frameworks analysiert, das durch Metatranskriptomdaten ergänzt wurde. Diese Daten ermöglichten es uns, die Beziehung zwischen häufig vorkommenden methanogenen Kerngemeinschaften und ihren syntrophischen Bakterienpartnern aufzuklären. Insgesamt haben wir 297 hochwertige, nicht redundante metagenomassemblierte Genome (nrMAGs) entdeckt. Darüber hinaus zeigten die zusammengestellten 16 S-rRNA-Genprofile dieser nrMAGs, dass der Stamm Firmicutes die höchste Kopienzahl aufwies, während die Vertreter der archaealen Domäne die niedrigste aufwiesen. Weitere Untersuchungen der drei anaeroben Mikrobengemeinschaften zeigten charakteristische Veränderungen im Laufe der Zeit, blieben jedoch spezifisch für jede Biogasanlage im industriellen Maßstab. Die relative Häufigkeit verschiedener Mikroorganismen, die durch Metagenomdaten ermittelt wurde, war unabhängig von den entsprechenden Metatranskriptomaktivitätsdaten. Archaeen zeigten eine deutlich höhere Aktivität, als aufgrund ihrer Häufigkeit zu erwarten war. Wir haben 51 nrMAGs entdeckt, die in allen drei Biogasanlagen-Mikrobiomen in unterschiedlicher Häufigkeit vorhanden waren. Das Kernmikrobiom korrelierte mit den wichtigsten chemischen Fermentationsparametern, und kein einzelner Parameter erwies sich als vorherrschender Einflussfaktor für die Zusammensetzung der Gemeinschaft. Hydrogenotrophen Methanogenen in den Biogasanlagen, die mit landwirtschaftlicher Biomasse und Abwasser betrieben werden, wurden verschiedene H2/Elektronentransfermechanismen zwischen den Spezies zugeordnet. Die Analyse der Metatranskriptomdaten ergab, dass die Methanogenesewege von allen Hauptstoffwechselwegen am aktivsten waren.

In technischen anaeroben Vergärungssystemen (AD) basieren der Abbau organischer Stoffe und die Biogasproduktion auf einem effizienten Nährstoffrecycling [1, 2]. An diesem Prozess ist eine vielfältige mikrobielle Gemeinschaft beteiligt, wobei jede Mikrobe eine spezifische Rolle spielt. Die Zusammensetzung und Funktion der an den AD-Stadien beteiligten Mikrobengemeinschaft spielen eine wichtige Rolle für die Effizienz des Gesamtprozesses, der auch von zahlreichen Faktoren wie Mikroben-Mikroben-Wechselwirkungen, Substratzusammensetzung, physikalisch-chemischen Parametern und Betriebsbedingungen beeinflusst wird [3,4,5,6].

Die Aufklärung mikrobieller Wechselwirkungen und der ihnen zugrunde liegenden Mechanismen ist eine komplizierte Aufgabe, da viele Mikroben ohne spezifische mikrobielle Partner nicht überleben können [7]. Es wurden innovative Methoden zur mikrobiellen Isolierung und Kultivierung entwickelt, von denen sich einige als erfolgreich bei der Einbringung neuartiger Mikroorganismen in die Kultur erwiesen haben [8]. Allerdings sind weitere Entwicklungen und Weiterentwicklungen dieser Technologien erforderlich, um das volle Potenzial der mikrobiellen Vielfalt auszuschöpfen [9, 10]. Da es starke syntrophische Wechselwirkungen zwischen den Mikroben in AD-Mikrobenkonsortien gibt, sind eingehende Untersuchungen erforderlich, um ihre Diversität, metabolische Rolle und Verteilung zu verstehen. Diese Studien wurden zunächst durch Einschränkungen behindert, die kulturabhängigen mikrobiologischen Methoden innewohnen, die die Isolierung von Mikroorganismen erfordern und eine Herausforderung darstellen können, wenn syntrophische Beziehungen allgegenwärtig sind [11,12,13]. Hochdurchsatz-Sequenzierungs- und Bioinformatik-Tools ermöglichen eine Massenanalyse von Genommaterial und liefern dadurch Einblicke in die Taxonomie und Funktionen ganzer mikrobieller Gemeinschaften [14,15,16].

Die Identifizierung und Genomcharakterisierung häufig vorkommender Mikroben in AD-Mikrobiomen kann entscheidende Pfade und ökologische Merkmale aufdecken, die an der mikrobiellen Nahrungskette beteiligt sind (17, 18). Frühere Studien mit 16 S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung zeigten, dass Kernmikroorganismen eine stabile Gemeinschaft bilden, die verschiedenen Störungen (z. B. AD-Parameteränderungen) widerstehen kann [19,20,21]. Amplikonsequenzierungs- und lesebasierte Metagenomik-Ansätze sind jedoch aufgrund ihrer Abhängigkeit von Referenzdatenbanken möglicherweise nicht in der Lage, unbekannte Arten durch Kernmikrobiomanalyse zu identifizieren (22, 23). Darüber hinaus stellen Biogas produzierende Gemeinschaften ein großes und vielfältiges Kontingent uncharakterisierter Mikroorganismen dar, die zuvor als „mikrobielle dunkle Materie“ beschrieben wurden [19, 24, 25]. Um dieses Problem anzugehen, können immer ausgefeiltere bioinformatische Algorithmen verwendet werden, um die Genome einzelner Arten (oder MAGs: Metagenome-Assembled Genomes) aus diesen komplexen Gemeinschaften zu rekonstruieren [26,27,28].

Mehrere neuere Studien mit genomaufgelöster Metagenomik haben charakteristische MAGs aus Biogasreaktoren im Labor- und Industriemaßstab gewonnen [23, 29, 30, 31]. Diese Studien zeigten, dass Bacteroides und Firmicutes aufgrund ihrer H2-, CO2- und Formiatproduktionsfähigkeiten vielseitige Wechselwirkungen mit hydrotrophen Methanogenen haben [17, 32]. Darüber hinaus ist die Ammoniakkonzentration der Hauptparameter, der die Methanogengemeinschaft prägt [29]. Es ist notwendig, Genomfragmente aus dem Metagenom effizient und genau zu rekonstruieren, um diese Wechselwirkungen in silico zu untersuchen [33, 34]. Kürzlich veröffentlichte Studien haben gezeigt, dass halbüberwachtes maschinelles Lernen die Binning-Leistung erheblich verbessern kann [35, 36], was – kombiniert mit dem Metatranskriptomik-Ansatz – eine tiefergehende Untersuchung mikrobieller Interaktionen in verschiedenen Umgebungen ermöglichen könnte.

Die vorliegende Studie untersuchte die Struktur und Funktion von Mikrobiomen in drei Biogasreaktoren in Industriegröße, die jeweils mit einem unterschiedlichen, charakteristischen Substrat gespeist wurden. Jeder Reaktor wurde in saisonalen Abständen über einen Zeitraum von einem Jahr überwacht. Zur Identifizierung der mikrobiellen Zusammensetzung und der laufenden Stoffwechselaktivitäten wurde eine Shotgun-Sequenzierung gefolgt von einem durch maschinelles Lernen gesteuerten genomzentrierten metagenomischen und metatranskriptomischen Analyserahmen verwendet. Der gemeinsame Teil der Mikrobengemeinschaft, der an der Verdauung heterogener Substrate beteiligt ist, wurde mithilfe eines auf Vorkommen basierenden Kerngemeinschaftskonzepts untersucht [37]. Das Hauptziel dieser Forschung bestand darin, die Beziehung zwischen der reichlich vorhandenen methanogenen Kernpopulation und bestimmten syntrophischen Bakterien aufzudecken. Insbesondere konzentrieren wir uns auf wichtige Netzwerke der Interspezies-Syntrophie und finden eine interessante Korrelation zwischen chemischen Fermentationsparametern und den in den Reaktoren vorhandenen anaeroben Kernmikrobiota.

Proben wurden aus drei hochmodernen anaeroben Fermentern in Ungarn entnommen. Zwei der Fermenter befinden sich in Szeged (MWBP und SZBP), der andere in Kecskemét (KBP). Die wichtigsten Merkmale jeder hier untersuchten Biogasanlage sind in Suppl zusammengefasst. Tabelle 1. Diese Biogasanlagen wurden anhand der folgenden Kriterien ausgewählt: (i) die Fermenter sind seit mehr als fünf Jahren ohne Probleme in Betrieb; und (ii) die Fermenter nutzen bestimmte Biopolymere als Hauptzersetzungssubstrat für die Biogasproduktion. Die Probenahme erfolgte über einen Zeitraum von einem Jahr in folgenden (saisonalen) Abständen: Oktober 2020, Januar 2021, April 2021 und Juli 2021. Die Proben wurden direkt ins Labor transportiert und sofort nach Ankunft verarbeitet. AD-Parametermessungen und DNA/RNA-Reinigung wurden an frischen Biogasanlagenproben (BP) in dreifacher Ausfertigung durchgeführt (dh biologische Dreifachansätze: n = 3).

Für jeden BP haben wir Folgendes gemessen: pH-Wert des Schlamms, Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C/N), Gesamtfeststoffgehalt (TS), Gehalt an flüchtigen Feststoffen (VS), Gesamtammoniakstickstoff (TAN; d. h. Ammoniumionen und gelöstes Ammoniak), flüchtig Gehalt an organischer Säure (VOA) und anorganischer Gesamtkohlenstoff (TIC). Die Messungen wurden wie zuvor veröffentlicht durchgeführt [38].

Chargentests zum biochemischen Methanpotenzial (BMP) wurden in 160-ml-Reaktorgefäßen (Wheaton-Glasserumflasche, Z114014 Sigma-Aldrich) mit 60 ml flüssiger Phase durchgeführt. Das Verhältnis von Inokulum (BP-Gehalt gefiltert, um Partikel größer als 2 mm zu entfernen) zu Substrat (α-Cellulose: C8002 Sigma-Aldrich) wurde gemäß der VDI-Norm 4630 (Vereins Deutscher Ingenieure 4630, 2006) auf das Verhältnis Inokulum zu Substrat VS eingestellt = 2:1. Eine detaillierte Beschreibung der Gasentnahme- und Messverfahren findet sich in einer früheren Veröffentlichung [39].

Aliquots von 2 ml wurden aus den Proben jedes BP für die DNA- und RNA-Isolierung der gesamten Gemeinschaft entnommen. Die Reinigung wurde dreifach durchgeführt und die resultierenden Extraktionen wurden gepoolt. Alle Extraktionen wurden mit ZymoBIOMICS DNA/RNA-Miniprep-Kits (R2002, Zymo Research, Irvine, USA) durchgeführt. Nach der Lyse (die Perlenhomogenisierung wurde mit einem Vortex Genie 2 mit einer Perlengröße von 0,1 mm, einer Homogenisierungszeit von 15 Minuten und bei maximaler Geschwindigkeit durchgeführt) wurde das parallele DNA- und RNA-Reinigungsprotokoll des Zymo Research Kits befolgt. Die DNA- und RNA-Mengen wurden mit einer Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) geschätzt.

Wir haben alle Herstellerempfehlungen für die Illumina-Sequenzierungsplattform (Illumina Inc., San Diego, USA) genau befolgt. Gepoolte genomische DNA-Proben wurden zur Sequenzierung von Bibliotheken verwendet, die mit dem NEBNext Ultra II Library Prep Kit (NEB, Ipswich, USA) erstellt wurden. Die Paired-End-Metagenomik-Sequenzierung wurde auf einem NextSeq 550 (Illumina)-Sequenziergerät unter Verwendung des NextSeq High Output Kit v2-Sequenzierungsreagenzkits durchgeführt. Die Metatranskriptomsequenzierung aus gepoolten RNA-Proben wurde wie folgt durchgeführt: Bibliotheken wurden zunächst mit einem Zymo-Seq RiboFree Total RNA Library Kit vorbereitet, das einen universellen rRNA-Depletionsschritt umfasst. Anschließend wurde die Paired-End-mRNA-Sequenzierung auf einem NextSeq 550 (Illumina)-Sequenziergerät unter Verwendung des NextSeq High Output Kit v2-Sequenzierungsreagenzkits durchgeführt. Die primäre Datenanalyse (dh Base-Calling) wurde mit der Software „bcl2fastq“ (Version 2.17.1.14, Illumina) durchgeführt. Charakteristische Fragmentparameter sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst.

Rohsequenzen wurden mit Fastp (Version 0.23.2, erforderliche Länge: 150 bp) gefiltert und mit FastQC (Version 0.11.8) überprüft. Die von fastp erzeugten gefilterten Sequenzen wurden dann separat von Megahit zusammengefügt (Version 1.2.9, 4 Proben pro BP = 3 Zusammenfügungen). Die verwendeten Einstellungen waren wie folgt: Min. Contig-Länge = 1500; min. k-mer-Größe = 21; maximale k-mer-Größe = 141 [40]. Das Metagenomik-Binning-Verfahren wurde bis zum Dereplikationsschritt für jeden AD-Metagenomik-Datensatz separat durchgeführt. Wir haben Anvi'o (Version 7: „hope“) verwendet, um die Contig-Datenbank für den folgenden Metagenomics-Workflow zu erstellen [41].

Die Genomrekonstruktion wurde mit Semibin (Version 1.1.1) durchgeführt, einem durch maschinelles Lernen gesteuerten Softwarepaket, das einen halbüberwachten Ansatz mit tiefen siamesischen neuronalen Netzen kombiniert, indem es einen erweiterten Co-Assembly-Binning-Workflow mit einem halbüberwachten Modus verwendet [35]. ]. Für die Dereplikation und Qualitätsfiltration von Metagenom-assemblierten Genomen (MAGs) verwendeten wir dRep (Version 2.2.3) und CheckM2 (Version 1.0.1) mit den folgenden Parametern: dereplicate: comp 10, con 5, S_algorithm fastANI, sa 0.95, und Vorhersagefunktion im Fall von CheckM2 [42, 43]. Es ist zu beachten, dass dRep CheckM1 verwendet, sodass die Kontamination von nrMAGs von den dRep-Filtereinstellungen abweichen kann (Ergänzungstabelle 3). MarkerMAG wurde im Standardmodus verwendet, um 16 S-rRNA-Gene zu erkennen, zusammenzusetzen und mit MAGs zu verknüpfen und die entsprechende Kopienzahl zu berechnen (matam_16s: pct 5,10,25,50,75,100 –i 0,99 und Verknüpfungsfunktion mit Standardparametern) [ 44].

Offene Leserahmen (ORFs) wurden von Prodigal (Version 2.6.3) identifiziert. InterProScan Version 5.31–70 wurde verwendet, um genkodierende Sequenzen mithilfe der Pfam-Datenbank funktional zu annotieren (45). Funktionsprofile wurden durch Daten aus den Funktionsmodulen der Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) von Anvi'o (anvi-run-kegg-kofams) ergänzt (46). Die an der Kohlenhydratverwertung beteiligten Enzyme wurden mithilfe einer Kombination aus Pfam-Funktionsprofilen und Daten aus der Kohlenhydrat-aktiven Enzymdatenbank (CAZy) identifiziert [47]. Anschließend verwendeten wir die Genome Taxonomic Database (GTDB: Release 207) mit GTDB-Tk (Version 2.1.1) für die taxonomische Zuordnung (48). Rekonstruierte nicht-redundante MAGs (nrMAGs), die eine Vollständigkeit von mehr als 90 % zeigten, wurden auch mit Einträgen in der Biogas-Mikrobiom-Datenbank [29] unter Verwendung von fastANI (Version 1.33) [49] verglichen. Die nrMAG-Statistiken sind in der Ergänzungstabelle 3 zusammengefasst.

Die Häufigkeitswerte von nrMAGs in jeder Probe wurden mit dem quant_bin-Modul von MetaWRAP (Version: 1.3.2) (unter Verwendung von Salmon) berechnet, ähnlich dem TPM-Berechnungsprozess (Transcript per Million), der sich hier auf „Kopien pro Million Lesevorgänge“ bezieht ( CPM; Ergänzungstabelle 4) [50]. Die Lesevorgänge werden an Contigs von nrMAGs ausgerichtet und die resultierenden Abdeckungswerte wurden nach Probengröße (für jeweils 1 Million metagenomische Lesevorgänge) und nach Contig-Länge (in Nukleotiden) standardisiert. Phylogenombäume wurden mithilfe eines Satzes von 120 bakteriellen und 53 archaealen Single-Copy-Core-Genen (SCGs) über GTDB-Tk (Version 2.1.1; classify_wf) und IQTree2 (Version 2.2.0.3) unter Verwendung der folgenden Parameter generiert: Anzahl der Bootstraps: 1000; maximale Iteration: 1000; Stoppregel: 100 [51, 52]. Das interaktive Tool Tree of Life (iTOL: Version 6.7.3; https://itol.embl.de/) wurde verwendet, um den phylogenomischen Baum sowie einige Binning-Ergebnisse zu visualisieren.

Wir haben zunächst ORFs aus MAGs mit bedtools: getfasta (Version: 2.27.1) extrahiert, um MAG-spezifische Genaufrufe zu erhalten. Diese haben wir dann kombiniert, um einen Salmon-Index zu erstellen (unter Verwendung des Parameters keepDuplicates; https://github.com/COMBINE-lab/salmon). Die Lesezahlen wurden mit Salmon (Version 1.8.0) im Quasi-Mapping-Modus mit GC-Bias-Korrektur (gcBias) berechnet. Die Hauptausgabedatei (quants.sf) enthält die quantifizierte Anzahl der Lesevorgänge (numReads) und deren Menge in TPM-Werten (Ergänzungstabelle 5). Der TPM-Berechnungsprozess (der in der vorliegenden Studie als Aktivitätsmetrik verwendet wird) wurde ähnlich wie zuvor erwähnt durchgeführt, wobei das effektive längengewichtete Gen (GC-Bias) und kartierte transkriptomische Lesevorgänge pro Probenkorrekturen herangezogen wurden.

BMP-Testergebnisse wurden mit ggplot2 (Version 4.1.3) visualisiert und signifikante Unterschiede zwischen den maximalen Biogaspotentialen (d. h. aus Chargentests mit α-Cellulose) wurden mit dem Paket ggsignif (Version 0.6.4) berechnet (d. h. unter Verwendung eines Between). -Paar-Wilcoxon-Test mit einfaktoriellen ANOVAs zum Vergleich mehrerer Gruppen) [53]. Die mehrdimensionale Skalierung von Proben (dh MDS-Diagramme zur Darstellung von Bray-Curtis-Unähnlichkeiten), die MAG-Häufigkeit und die Aktivitätswerte wurden mit microViz (Version 0.9.0) visualisiert [54]. Euklidische Abstände und Unterschiede zwischen Proben wurden berechnet (mittels permutationaler multivariater Varianzanalyse; PERMANOVA: n_perms: 1000) und mit dem microeco R-Paket (Version 0.14.1) visualisiert (55). Um die Signifikanz von Unterschieden zwischen MAGs zu bewerten, haben wir lefser (das R-Paket für den Effektgrößenrechner der linearen Diskriminanzanalyse; Version 4.3) in microeco mit einem Signifikanzschwellenwert von p ≤ 0,05 (trans_diff: alpha = 0,05, p_adjust_method = fdr, lefse_min_subsam) verwendet = 10, lefse_norm = 1e + 06, boots = 30) [56].

Anschließend analysierten wir die Vorkommensdaten, um das Kernmikrobiom zu identifizieren. Ein in 83,3 % der Proben (d. h. in 10 von 12) beobachtetes Taxon mit einer Häufigkeit von mehr als 1 (~10-fache Genomabdeckung) wurde als Mitglied des Kernmikrobioms angesehen [37]. Die Pakete ggvenn und ggtern (Versionen 0.1.10 und 3.4.1) wurden verwendet, um die Verteilung des Kernmikrobioms (auf Arten- und Stammebene) zwischen den BPs zu visualisieren [53]. Die Analyse des gleichzeitigen Vorkommens und die Korrelationen zwischen AD-Parametern und taxonomischen IDs von Kernmikrobiommitgliedern (auf Artenebene oder anderweitig auf der höchsten taxonomischen Ebene) wurden von Microeco berechnet (55). NetComi (Netzwerkkonstruktion und -vergleich für Mikrobiomdaten; Version 1.1.0) wurde zur Berechnung und Normalisierung der Assoziationsmatrix verwendet (trans_network: cor_method = Pearson, use_NetCoMi_pearson_spearman = TRUE, filter_thres = 0,001, dann cal_network: COR_p_thres = 0,01, COR_cut = 0,7). [57, 58]. Zur Visualisierung der Zusammenhänge wurde das ggraph-Paket (Version 2.1.0) verwendet. Um Korrelationen zwischen Mikroorganismen und chemischen Parametern aufzudecken, wurde die Funktion trans_env verwendet (use_data = Species, cor_method = Pearson, p_adjust_method: fdr).

Die Ergebnisse der Metagenomik- und Metatranskriptomik-Analysen kohlenhydrataktiver Enzyme wurden von Circos online (http://circos.ca/) und ggplot2 visualisiert. Die differenzielle Genexpressions- und Anreicherungsanalyse wurde mit dem in R implementierten DESeq2-Paket (1.34.0) durchgeführt (59). Lachs-Quant-Dateien (quants.sf) wurden mit tximport (Version 1.22.0; Einstellungen: Typ = Lachs, txOut = TRUE) in R importiert (https://github.com/mikelove/tximport). Wir haben die Zählungen gefiltert, um Gene mit mindestens 5 Lesevorgängen in 4 Proben aus Salmon-Alignments (numReads) beizubehalten und durch DESeq2 (mit Standardparametern; Ergänzungstabelle 5) normalisiert. Um schließlich deutlich unterschiedliche Gene zu visualisieren, verwendeten wir das Paket ggplot2 (mit den folgenden Einstellungen: log2 FC: ≥2,0, p ≤ 0,05).

Proben wurden aus den anaeroben Fermentern von drei BPs im industriellen Maßstab entnommen („AD-Proben“ und Ergänzungstabelle 1). KBP wurde hauptsächlich mit Hühnermist und vorbehandeltem Weizenstroh gefüttert; SZBP wurde mit Schweinegülle und Maissilage gefüttert; und MWBP-behandelter kommunaler Abwasserschlamm, der verschiedene Materialien enthält. Alle Fermenter wurden bei mesophilen (dh 36 °C bis 38 °C) Temperaturen in kontinuierlich gerührten Tankreaktoren betrieben. Während des saisonalen Überwachungszeitraums (dh vier Probenahmestellen pro BP) arbeiteten alle Reaktoren stabil und es wurden keine Ausfälle gemeldet.

Um das maximale Biogaspotenzial der verschiedenen AD-Gemeinschaften zu messen, wurden Standard-BMP-Tests durchgeführt (siehe Einzelheiten unter „Bestimmung der chemischen AD-Parameter“). Die Methanausbeuten variierten von 340 ml (Standardabweichung: 2,6 ml) bis 376 ml g VS−1 (SD: 14,6 ml). Obwohl das Inokulum für BMP-Tests aus Fermentern stammte, die mit unterschiedlichen Substraten beschickt wurden, waren die Methanausbeuten sehr ähnlich (Abb. 1A). Darüber hinaus zeigten Tests zu den Zeitpunkten Oktober, Januar, April und Juli alle ähnliche Methanausbeuten bei den drei Biogasanlagen (Abb. 1B; für April: KBP = 362 ± 14,6; MWBP = 356 ± 2,4; und SZBP = 365 ±). 7,6 ml Methan g VS−1). In früheren Untersuchungen wurden ähnliche Methanpotenzialbereiche in BPs beobachtet, die verschiedene Arten von Biomasse landwirtschaftlichen oder kommunalen Ursprungs verdauen [60,61,62].

A Ergebnisse der Standard-BMP-Testmessungen von drei BPs (siehe: „AD-Proben“). B BMP-Methanerträge über die getesteten Zeiträume. C Chemische Parameter der anaeroben Vergärung des Schlamms aus einzelnen BP-Fermentern (C/N-Kohlenstoff-zu-Stickstoff-Verhältnis, TAN Gesamtammoniakstickstoff, VOAs flüchtige organische Säuren, TIC Gesamtanorganischer Kohlenstoff, TS Gesamtfeststoffe, VS flüchtige Feststoffe). Mittelwertunterschiede wurden mittels ANOVA analysiert und wie folgt als statistisch signifikant angesehen: p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), ns kein signifikanter Unterschied.

Obwohl die wichtigsten chemischen Prozessparameter im optimalen Bereich lagen [63,64,65], zeigten sie deutliche Unterschiede zwischen den drei BP-Reaktoren (Ergänzungstabelle 1). Die folgenden Parameter wurden gemessen: flüchtige organische Säuren (VOAs), gesamter anorganischer Kohlenstoff (TIC), gesamter Ammoniakstickstoff (TAN), Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C/N), Gesamtfeststoffe (TS) und flüchtige Feststoffe (VS). ). Von diesen zeigten die C/N-, VOAs- und TAN-Konzentrationen die höchste Variabilität unter den BPs (ANOVA: p <0,05) (Abb. 1C). Diese Werte waren bei MWBP typischerweise niedriger (p < 0,01) im Vergleich zu denen bei KBP und SZBP [66].

Halbüberwachtes Binning, ergänzt durch maschinelles Lernen (ML), ist ein kürzlich entwickelter Ansatz, der sich als äußerst nützlich für die Erweiterung des Wissens über mikrobielle Genomik erwiesen hat. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass ein ML-basiertes lebensraumspezifisches Modell den Metagenom-Binning-Prozess für komplexe Mikrobiome verbessert und bestehende unbeaufsichtigte Methoden auf der Basis der Nukleotidzusammensetzung und der Häufigkeit (z. B. Metabat2) übertrifft (35, 36). Aufgrund der ungewöhnlichen Lesetiefe und der atypischen Nukleotidzusammensetzung fehlen ribosomale RNA-Gene jedoch häufig in MAGs, die aus Short-Read-Sequenzierungsdaten gewonnen wurden (34, 44). Diese Gene sind für die Untersuchung der Genomik und Phylogenie unkultivierter Mikroorganismen unerlässlich und ermöglichen Analysen, die MAG-Daten mit 16 S rRNA-Gendatenbanken verbinden.

In der vorliegenden Studie haben mehr als 296 Millionen metagenomische Sequenzablesungen den Filterschritt bestanden (mit einem Durchschnitt von 24,6 Millionen Reads pro Probe). Gefilterte Lesevorgänge wurden von Megahit zusammengefügt (drei unabhängige Baugruppen pro BP), was insgesamt 283.491 Contigs ergab (KBP: 107.920; MWBP: 98.415; SZBP: 77.156 Contigs; Einzelheiten siehe: Suppl. Tabelle 2). Für jeden zusammengesetzten Contig-Satz wurde eine genomzentrierte Metagenomik-Strategie verfolgt. Der dereplizierte und qualitätsgefilterte Satz von MAGs wurde dann für die weitere Analyse verwendet. Semibin produzierte 297 nrMAGs (nr = nicht redundant), von denen 107 (36 %) eine Vollständigkeit von mehr als 90 % aufwiesen. Es ist bemerkenswert, dass durch die CheckM2-Analyse festgestellt wurde, dass 6 % der nrMAGs eine Kontamination von 0 % und weitere 90 % eine Kontamination von > 5 % enthielten (Abb. 2A und B). Darüber hinaus wurden 24 % der nrMAGs (n = 70) auf einem Qualitätsniveau identifiziert, das höher war als das ihrer Vertreter in der Genom-Taxonomie-Datenbank (Ergänzungstabelle 3). Diese Beobachtungen bestätigen die Wirksamkeit von Semibin als Binning-Verfahren für komplexe anaerobe Biogas produzierende Gemeinschaften [35]. Darüber hinaus kann die größere Anzahl eindeutiger nrMAGs, die von Semibin gruppiert werden, auch zu einer besseren Kartierung von Metatranskriptomdaten führen.

Ein Vergleich der Vollständigkeit und Kontamination der nicht redundanten metagenomassemblierten Genome (nrMAGs), die von Semibin erstellt und von CheckM2 unter Verwendung des Standardsatzes von SCGs analysiert wurden. B Verteilung der von Semibin rekonstruierten nrMAGs basierend auf Vollständigkeit und Kontamination. Da dRep CheckM1 verwendet, kann die Kontamination von nrMAGs von den dRep-Filtereinstellungen abweichen. C Geschätzte 16 S-rRNA-Genkopienzahl für 22 Phyla (dh zwei Archaea- und 20 Bakterientaxa). Für einige Phyla konnte die Kopienzahl eines Vertreters bestimmt werden: Methanobacteriota, Firmicutes F, Firmicutes D, Planctomycetota, Proteobacteria und Thermotogota.

Das MarkerMAG-Programm wurde dann verwendet, um 16 S-rRNA-Gene aus Metagenomen zu erkennen, zusammenzusetzen und mit MAGs zu verknüpfen und die Kopienzahlen abzuschätzen (siehe: Materialien und Methoden „Metagenomassemblierung und Binning“ und Ergänzungstabelle 3) [44]. In der vorliegenden Studie wurden 16 S-rRNA-Gene (Mindestlänge: 1200 Nukleotide) in 82 nrMAGs nachgewiesen, die auf 22 Phyla verteilt waren (was 28 % aller nrMAGs entspricht). Vertreter der Firmicutes besaßen die höchste geschätzte mittlere Kopienzahl dieses Gens (3,6 Kopien), während Mitglieder der Halobacteriota und Methanobacteriota mit durchschnittlich jeweils 1,3 Kopien die niedrigsten Kopienzahlen aufwiesen (Abb. 2C). Zusammen mit früheren wissenschaftlichen Berichten deuten unsere Daten darauf hin, dass die Amplikonsequenzierung von 16 S-rRNA-Genen die Häufigkeit der Archaeengemeinschaft in AD unterschätzt hat [67, 68]. Eine Methode zur besseren Abschätzung der mikrobiellen Häufigkeit, die sich aus der 16 S-rRNA-Gensequenzierung ergibt, besteht darin, die Ergebnisse anhand der Kopienzahl pro erkanntem Genom zu normalisieren (69). Allerdings ist die tatsächliche Kopienzahl des 16 S-rRNA-Gens für viele Prokaryoten unbekannt [34]. Aktuelle bioinformatische Lösungen zur Normalisierung von Amplikon-Sequenzierungsdaten basieren auf der offensichtlichen phylogenetischen Erhaltung einzelner Genkopien, und diese Annahme gilt möglicherweise nur für kurze phylogenetische Distanzen [70]. Genomaufgelöste Metagenomik in Kombination mit der Detektion von 16 S-rRNA-Genen könnte dazu beitragen, diese Wissenslücke zu schließen.

Insgesamt stellten wir fest, dass die drei AD-Reaktoren unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften beherbergten. Die mehrdimensionale Skalierung (MDS; implementiert mit dem Bray-Curtis-Unähnlichkeitsmaß) ergab, dass die Varianz in der Mikrobiomzusammensetzung über die drei Biogasanlagen hinweg deutlich größer war (PERMANOVA: p = 0,001) als die Varianz in der Mikrobiomstruktur über verschiedene Probenahmepunkte jedes einzelnen Biogases Anlage. Die Mikrobiome der verschiedenen BPs zeigten im Laufe der Zeit charakteristische Veränderungen, aber in jedem Fall waren diese Veränderungen für diese Pflanze charakteristisch (Abb. 3A). Dieser Befund wurde durch Berechnungen des euklidischen Abstands bestätigt, die darauf hindeuteten, dass die Mikrobiome von KBP und SZBP einander ähnlicher waren als denen von MWBP (Abb. 3B). In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen bestätigten unsere Analysen, dass die KBP- und SZBP-Mikrobiome überwiegend Bacteroidia, Clostridia und Limnochordia enthielten, während das MWBP-Mikrobiom Bacteroidia, Anaerolineae und Actinomycetia enthielt (Abb. 3D) [29, 31, 71]. Wir können daher den Schluss ziehen, dass es eine gemeinsame mikrobielle Gemeinschaftslandschaft gibt, die die wichtigsten Taxa umfasst, die in den hier untersuchten Biogasfermentern vorkommen [3, 4].

Eine mehrdimensionale Skalierung von Proben. Dieses Maß zeigt die Bray-Curtis-Unterschiede der mikrobiellen Gemeinschaft auf der Ebene der Artenanmerkung oder höher an. Jedes Symbol bezieht sich auf eine bestimmte Blutdruckprobe. Okt, Jan, April und Juli geben die Monate an, in denen die Proben gesammelt wurden. B Euklidischer Abstand von BP-Proben. Dieses Maß stellt die Unähnlichkeit mikrobieller Gemeinschaften auf der Ebene der Artenanmerkung oder höher dar. C Taxonomische Verteilung von nrMAGs auf Domänenebene für die drei BPs (in CPM %). D Taxonomische Verteilung von nrMAGs. Dies zeigt die am häufigsten vorkommenden Taxa in allen zwölf entnommenen Proben (dh in jedem BP-Zeitpunkt-Paar), aufgelöst auf der taxonomischen Ebene der Klasse (angezeigt in CPM %). Die roten Namen weisen darauf hin, dass sie nicht zu den 15 aktivsten Klassen gehören. E Die gesamte metatranskriptomische Aktivität archaischer Mikroorganismen, die an verschiedenen methanogenen Signalwegen beteiligt sind (Mischung: zeigt diejenigen nrMAGs an, die alle drei methanogenen Signalwege nutzen können). F Kumulative metatranskriptomische Aktivität von nrMAGs auf taxonomischer Domänenebene für die drei BPs (dargestellt in TPM %). G Die metatranskriptomische Aktivität von nrMAGs. Dargestellt sind die aktivsten Taxa, die in allen zwölf entnommenen Proben vorhanden sind (dh in jedem BP-Zeitpunkt-Paar), aufgelöst auf taxonomischer Ebene der Klasse (angezeigt in TPM %). Die roten Namen weisen darauf hin, dass sie nicht zu den 15 am häufigsten vorkommenden Klassen gehören.

Die Untersuchung der mikrobiellen Häufigkeit und Aktivität anhand der Metagenom- und Metatranskriptom-Datenverteilungen ergab deutliche Muster. Basierend auf der relativen Häufigkeit (CPM %) waren die drei am häufigsten gefundenen Klassen Bacteroidia, Clostridia und Limnochordia, obwohl die Aktivität (TPM %) von Methanosarcina die Mitglieder dieser Klassen übertraf. Darüber hinaus fanden wir auch auffällige Unterschiede in Rang und taxonomischer Zusammensetzung zwischen den 15 aktivsten nrMAGs im Vergleich zu den am häufigsten vorkommenden Mikrobenklassen (Abb. 3D und G). Daher weicht die relative Häufigkeit von Mikroorganismen von der relativen metatranskriptomischen Aktivität ab. Insgesamt zeigten die Vertreter der Domäne Archaea höhere Aktivitäten als Häufigkeit, wie durch den Vergleich der TPM%- mit den CPM%-Werten belegt wird (Abb. 3C und F; Ergänzungstabellen 4 und 5). Dieses Phänomen wurde auch in einer anaeroben Biogas produzierenden Gemeinschaft beobachtet [72].

Die durch Metatranskriptomik identifizierten methanogenen Archaeen zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtaktivität aller drei Biogasanlagen im industriellen Maßstab (Abb. 3E). Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die methanogenen Archaeen eine vergleichbare Funktionalität aufweisen, ungeachtet der Unterschiede in den Bedingungen und Parametern in den verschiedenen Biogasanlagen. Diese Widerstandsfähigkeit ist möglicherweise auf die Vielfalt der methanogenen Archaeen in den Fermentern zurückzuführen, die der methanproduzierenden Gemeinschaft Redundanz verleihen können [19, 73, 74, 75].

Basierend auf bekannten linienspezifischen Markergensätzen (SCGs) und auf MIMAG-Daten entdeckten wir 36 % nrMAGs hoher, 34 % mittlerer und 30 % niedriger Qualität [76]. Anschließend wurde die Genome Taxonomy Database (GTDB) für die taxonomische Zuordnung rekonstruierter nrMAGs verwendet. Diese Ergebnisse zeigten, dass nrMAGs in 33 Phyla eingeteilt werden konnten, von denen drei zu den Archaeen und 30 zu den Bakterien gehörten (Abb. 4 und Ergänzungstabelle 3).

Die Hintergrundfarbe des inneren Stammbaums markiert die Zugehörigkeit des Stammes zum ersten Ring und zeigt die nrMAG-Nummer an. In den nächsten beiden Ringen stellen die Symbole das Vorhandensein spezifischer nrMAGs in den Datenbanken Biogas Microbiome (grün) und GTDB (orange) dar. Die roten Symbole markieren die sieben nrMAGs, die eine hohe Vollständigkeit (>90 %) und eine geringe Kontamination (<5 %) aufweisen und in keiner verfügbaren Datenbank gefunden wurden (Archaea: MAG_165_3; Bakterien: MAG_114_1, _18_1, 29_1, 77_1, 87_1 und 95_2). Lila Symbole stellen die Kern-nrMAGs dar. Der äußere Ring stellt Bakterien dar, die im jeweiligen BP deutlich häufiger vorkommen (unter Verwendung von Lefser, p < 0,05).

Die nrMAGs wurden mit der Biogas-Mikrobiom-Datenbank verglichen, wobei das fastANI-Tool zur Berechnung der durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI) verwendet wurde (29). Diese Datenbank enthält einen umfassenden Satz mikrobieller Genome, die zuvor in Biogasanlagen gefunden wurden. Wir fanden heraus, dass 83 % der rekonstruierten hochwertigen nrMAGs (Vollständigkeit > 90 %; n = 107) in der Biogas-Mikrobiom-Datenbank vorhanden waren (ANI-Cutoff: 95 %). Es ist erwähnenswert, dass sieben hochwertige nrMAGs, die 7 % der gesamten hochwertigen nrMAGs (n = 107) und 2 % aller nrMAGs (n = 297) ausmachten, in keinem der beiden Fälle einem nächstgelegenen Vertreter zugeordnet werden konnten Datenbank. Diese nrMAGs wurden als neu eingestuft, da sie die folgenden Kriterien nicht erfüllten: Identifizierung auf Artenebene mit 95 % Referenzradius für GTDB und ≥ 95 % ANI für Biogas-Mikrobiom (Abb. 4 und ergänzende Tabelle 3). Es wurde festgestellt, dass drei hochwertige nrMAGs auch 16 S-rRNA-Gensequenzen enthielten (Ergänzungstabelle 3). Darüber hinaus zeigten die sieben mutmaßlichen neuen nrMAGs eine hohe Häufigkeit und Aktivität und machten 3 % der Gesamtzahl pro Million (CPM) bzw. 5 % der Gesamttranskripte pro Million (TPM) im untersuchten Mikrobiom aus. Diese nrMAGs könnten Mitglieder der hypothetischen mikrobiellen Dunklen Materie sein, die nun in den Bereich bekannter Teilnehmer in AD-Gemeinschaften freigesetzt werden kann.

Mithilfe einer genomzentrierten Metagenomik-basierten Kernmikrobiomanalyse wurden potenziell relevante Taxa identifiziert, die möglicherweise eine Rolle bei der Gestaltung der mikrobiellen Kerngemeinschaft spielen. Diese makroökologische Studie wurde daher durch Metatranskriptomdaten gestützt (Abb. 5 und ergänzende Abb. 1) [37]. Diese Analysen geben Einblick in die Beziehung zwischen nrMAGs und AD-Parametern sowie in ihre Rolle bei der Gestaltung des Kernmikrobioms.

Ein Venn-Diagramm zeigt die Gesamtzahl der nrMAGs und die Anzahl der gemeinsam genutzten nrMAGs zwischen den drei BPs (Prozentsätze wie angegeben). B Ternäres Diagramm, das die Verteilung bakterieller und archaischer nrMAGs zwischen BPs zeigt. Die Punktfarbe stellt den Stamm dar, zu dem die nrMAGs gehören. Die Größe des Punkts ist proportional zur Gesamthäufigkeit (dh dem kumulativen CPM-Wert in allen BPs) spezifischer nrMAGs.

Die Untersuchung der Verteilung rekonstruierter nrMAGs in bestimmten Biogasanlagen ergab, dass MWBP das einzigartigste Mikrobiom der drei untersuchten Systeme besaß. KBP und SZBP zeigten etwas überlappende Mikrobiome, wie aus den MDS- und Euklidischen Distanzberechnungen hervorgeht. Dennoch konnten wir in allen drei Fermentern 51 nrMAGs nachweisen (Abb. 5A). Die meisten der identifizierten Kern-nrMAGs waren Vertreter bekannter hydrolysierender Bakterien (z. B. Firmicutes, Bacteriodota) und Methanogene mit vielseitigen Stoffwechselaktivitäten (z. B. Halobacteriota, Methanobacteriota). Diese Mikroorganismen spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Biogasproduktivität und der nachhaltigen Systemleistung [14, 77]. Obwohl einige nrMAGs in allen Fermentern vorhanden waren, schwankte ihre Häufigkeit erheblich. Unter den Kernbakterien wurden die Phyla Firmicutes, Firmicutes A und Bacteriodota sowohl in SZBP als auch in KBP gefunden, während Mitglieder der Verrucomicrobiota, Armatimonadota und Chloroflexota in MWBP vorherrschten [6, 29, 66] (Abb. 4 und 5B).

Es wurde eine Analyse des gleichzeitigen Vorkommens von nrMAGs durchgeführt und ihre Korrelationen mit den chemischen AD-Parametern berechnet („Statistische Analyse“) (Abb. 6). Die Netzwerkanalyse des gleichzeitigen Vorkommens zeigte, dass die Mehrheit der Methanogene eine positive Korrelation mit den Phyla Bacteroidota und Firmicutes aufwies. Die Hauptparameter, die die Häufigkeit der Kernmikroorganismen beeinflussten, waren TAN, VOAs und TIC (Pearson-Rho > 0,5). Basierend auf dieser Beobachtung wurden acht Cluster aufgetragen, die charakteristische Korrelationen mit chemischen AD-Parametern zeigten (Abb. 6B). Die acht Cluster lassen sich in zwei Gruppen einteilen, wobei Mikroorganismen aus den Clustern I–V positiv mit den Haupteinflussparametern korrelieren und Mikroorganismen aus den Clustern VI–VIII negativ mit diesen Parametern korrelieren. Wir fanden auch heraus, dass Top-Core-nrMAGs der Stämme Firmicutes, Spirochaetota und Methanobacteriota positiv mit TAN, VOAs und TIC korrelierten, während Mitglieder des Stammes Bacteroidota auch mit vielen der gemessenen Parameter korrelierten. Schließlich zeigte das C/N-Verhältnis einen stärkeren Einfluss auf Bacteroidota als auf Firmicutes unter den Top-Core-nrMAGs (Abb. 6B).

A-Pearson-Korrelationen zwischen Kern-nrMAGs. Die Robustheit wird berechnet, wenn der angepasste signifikante p-Wert ≤ 0,05 ist und der Korrelationsindex (Pearson's Rho) basierend auf dem Netzwerk > 0,7 ist. Die blauen Linien stellen positive Korrelationen dar (Pearson-Rho > 0,7), rote Linien stellen negative Korrelationen dar (Pearson-Rho < −0,7). Ein mit einem Sternchen markierter Stamm ist unter den entsprechenden Mikroorganismen nicht vorhanden. B Pearson-Korrelationen zwischen Kern-nrMAGs und gemessenen chemischen AD-Parametern. Sternchen stellen die signifikanten Korrelationen dar (die wie folgt als statistisch signifikant angesehen werden: p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), p < 0,0001 (***), ns (kein signifikanter Unterschied)). Unter Verwendung des links gezeigten Kladogramms und der Daten für TAN (Gesamt-Ammoniak-Stickstoff), VOAs (flüchtige organische Säuren), TIC (Gesamt-anorganischer Kohlenstoff), TS (Gesamtfeststoffe) und C/N (Kohlenstoff-zu-Stickstoff-Verhältnis) wurden acht Cluster ermittelt ausgezeichnet. Diese werden hier farblich getrennt wie folgt dargestellt: Cluster I: grau; Cluster II: braun; Cluster III: gelb; Cluster IV: grün; Cluster V: lila; Cluster VI: blau; Cluster VII: orange; und Cluster VIII: dunkelgrün. Farbige Kästchen stellen die spezifischen Phyla dar, zu denen die nrMAGs gehören. Rote Punkte stellen die am stärksten hydrolysierenden nrMAGs dar (n = 10).

Es wurde festgestellt, dass die Gattung Methanoculleus (Phylum Halobacteriota, die Hydrogenotrophe Methanogene darstellt) eine vielfältige Gemeinschaft im Kernmikrobiom darstellt. Die repräsentativen Methanoculleus-Arten, die eine positive Korrelation mit den TAN- und VOA-Konzentrationen aufwiesen, waren bei KBP und SZBP vorherrschend, während diejenigen mit einer negativen Korrelation bei MWBP häufiger vorkamen. Darüber hinaus kamen sie gemeinsam mit Mitgliedern der Phyla Bacteroidota und Firmicutes vor. Mikroorganismen der Phyla Bacteroidota und Firmicutes können über Acidogenese und Acetogenese organische Säuren, Alkohole, Wasserstoff (H2) und Kohlendioxid (CO2) produzieren, und viele dieser Mikroorganismen existieren in Syntrophie mit acetotrophen und hydrotrophen Methanogenen. Die hydrotrophen Methanogene verbrauchen Wasserstoff über den Interspezies-Wasserstofftransfer (IHT) und nutzen die Energie, die durch die Reduktion von CO2 zu Methan gewonnen wird [78]. Die wasserstoffverbrauchenden methanogenen Mikroorganismen können Wasserstoff schnell abfangen und den Wasserstoffpartialdruck auf einem niedrigen Niveau halten. Dies führt zu thermodynamisch günstigen Bedingungen für die wasserstoffproduzierenden acetogenen Bakterien, um organische Verbindungen in Acetat, H2 und CO2 abzubauen [14, 79, 80].

Zwei Arten methanogener Archaeen, Methanoculleus sp002497965 und Methanospirillum sp0125200015 (bezeichnet als MAG_26_2 und MAG_103_2), wurden in Cluster VI gefunden und zeigten eine negative Korrelation mit Methanoculleus bourgensis und Methanoculleus-Arten 1, die zu Cluster II und III gehören. MAG_26_2 und MAG_103_2 waren häufig im MWBP-Mikrobiom vorhanden (Abb. 4). Methanoculleus sp002497965 und Methanospirillum sp0125200015 wurden ursprünglich in AD-Mikrobiomen identifiziert, aber nach unserem besten Wissen sind detaillierte Informationen über diese Mikroorganismen noch nicht verfügbar [81,82,83,84].

In der vorliegenden Studie wurden MAG_26_2 und MAG_103_2 anhand von Metatranskriptomikdaten als streng hydrotrophe Methanogene eingestuft. Darüber hinaus zeigten sie eine negative Korrelation mit den TAN- und VOA-Konzentrationen (Pearson-Rho > −0,7). Basierend auf genomischen Daten gehören diese Archaeen zur Klasse der Methanogene, die in der Lage sind, die hydrotrophe Methanogenese unter Verwendung von Formiat als Elektronendonor aufrechtzuerhalten. Typischerweise wird Formiat durch Formiatdehydrogenase zu CO2 oxidiert und anschließend weiter zu Methan reduziert [85]. Hier wurde der Interspezies-Formiattransfer (IFT) durch mikrobielle Partner aufrechterhalten, nämlich SR-FBR-E99 sp002497965 und LD21 sp012519515 (aus dem Stamm Bacteroidota; MAG_72_3 und MAG_394_2), die positiv mit MAG_26_2 und MAG_103_2 korrelierten (Abb. 6A). Diese MAGs wurden bereits in Biogasanlagen nachgewiesen und aufgrund ihrer vielseitigen Hydrolysefähigkeit beschrieben. Abgesehen von der Kohlenhydratverwertung sind sie Protein- und Aminosäure-abbauende Mikroorganismen, die Formiat produzieren können. Sie wurden auch regelmäßig neben Formiat verwertenden Methanogenen nachgewiesen [86].

Unter den reichlich vorhandenen Kern-nrMAGs identifizierten wir Methanothrix sp016706325 (MAG_97_2), ein Archäon, das offenbar zur acetotrophen Methanogenese fähig ist (ergänzende Abbildung 1). Basierend auf seinem MAG-Metatranskriptomprofil führt es in erster Linie eine acetotrophe Methanogenese durch und kann über den direkten Elektronentransfer zwischen den Spezies (DIET) Elektronen aufnehmen, um die CO2-reduzierende Methanogenese voranzutreiben. Unsere Daten deuten darauf hin, dass es über hochaktive Acetyl-CoA- und F420-Biosynthesewege sowie einen aktiven, membranassoziierten Elektronentransfer (Cytochrom C-Transmembranprotein; Ergänzungstabelle 4) verfügt. Einer früheren Studie zufolge zeigen Methanothrix-Arten eine höhere Aktivität, wenn sie einen Teil ihrer Energie aus der Ernährung beziehen, anstatt sich ausschließlich auf Acetat zu verlassen. Allerdings sind die Informationen über ihre natürlichen syntrophischen Partner begrenzt [87]. Dieses Archäon (mit Methanospirillum sp0125200015) ist eng mit Methanoculleus sp002497965 verbunden. Es wurde festgestellt, dass dieses archaische Netzwerk zusammen mit den zuvor erwähnten Aminosäuren abbauenden Mikroorganismen auftritt (Abb. 6A). Diese Mikroorganismen verfügen auch über aktive C-Typ-Cytochrome und die Fähigkeit zur Pili-Synthese, die beide für die Ernährung wesentlich sind (MAG_72_3 und MAG_394_2; Ergänzungstabelle. 5) [79, 88, 89, 90]. Bei Stoffwechselprozessen können Elektronen durch Reduktionsäquivalente wie reduziertes Ferredoxin erzeugt und transportiert werden. Um diese Elektronenträger erneut zu oxidieren, kann die Formiatproduktion die Nutzung von Elektronenentsorgungswegen zur Energieeinsparung ermöglichen [86]. Somit könnte Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) eine wesentliche Rolle in der Biogas produzierenden Gemeinschaft spielen, indem es die Elektronenentsorgungswege unterstützt [91]. Basierend auf Daten aus der wissenschaftlichen Literatur sowie einer umfassenden Analyse von anaeroben Fermentern in dänischen Kläranlagen zeigten Vertreter von Methanothrix eine negative Korrelation sowohl mit den Acetat- als auch mit den TAN-Konzentrationen [66, 92, 93].

Korrelationen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften und chemischen Prozessparametern deuten auf einen ausgeprägten Elektronentransfermechanismus während der AD von landwirtschaftlicher Biomasse und Abwasser hin. Diese Prozesse korrelieren negativ mit VOAs und TAN-Werten und treten häufig auf, wenn Elektronenentsorgungswege reichlich vorhanden sind. Unsere Daten und früheren Studien legen beispielsweise nahe, dass proteinhydrolysierende und Aminosäure abbauende Mikroorganismen – die gemäß der GTDB-Taxonomie zum Stamm Bacteroidota und zur Familie VadinHA17 gehören (Ergänzungstabelle 3) – syntrophische Beziehungen mit hydrotrophen Methanogenen aufbauen, um die Formiatproduktion aufrechtzuerhalten und Elektronen über DIET entsorgen [86].

Kohlenhydrataktive Enzyme (CAZymes) sind für den Abbau polymerer Kohlenhydrate verantwortlich. Um diesen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt zu charakterisieren, wurde der Metatranskriptom-Datensatz anhand eines kombinierten Datensatzes auf Basis der Pfam- und CAZy-Datenbanken auf verschiedene CAZyme und Anzeichen von CAZyme-Aktivität abgefragt (Abb. 7). Identifizierte CAZyme wurden dann mit nrMAGs verknüpft (siehe: „Assemblierung und Binning von Metagenomen“).

Ein Circos-Diagramm, das die identifizierten CAZyme-Klassen und ihre Aktivitätsverteilung über die Bakterienstämme hinweg veranschaulicht. Die Enzyme wurden in fünf CAZyme-Klassen eingeteilt. Glykosyltransferasen (GTs) zeigten die höchste Aktivität, gefolgt von Glykosidhydrolasen (GHs), Kohlenhydratbindungsmodulen (CBMs), Kohlenhydratesterasen (CE) und Polysaccharidlyasen (PL). Insgesamt wurde in allen beobachteten mikrobiellen Phyla GH- und GT-Aktivität nachgewiesen. Die meisten (51 % TPM) CBM-Aktivitäten standen im Zusammenhang mit Firmicutes und Bacteroidota. B Heatmap weit verbreiteter und gemeinsamer Enzymfamilien der Glykosidhydrolase (GH). Die GH-Aktivität wird durch farbige Kästchen angegeben. C Heatmap der Aktivitäten der Enzymfamilien Kohlenhydrat-bindendes Modul (CBM) und Glykosidhydrolase (GH) für die 30 wichtigsten Mikrobenarten (dargestellt in log10-TPM-Werten). Rote Punkte zeigen spezifische nrMAGs an, die in der Kerngemeinschaft vorhanden sind (n = 10).

Unter den identifizierten CAZymen sind die Glykosidhydrolasen (GHs) eine wichtige Enzymfamilie, die am Abbau komplexer Kohlenhydrate beteiligt ist (Abb. 7A) [94]. Zu dieser vielfältigen Enzymfamilie gehören Cellulasen, Hemicellulasen, Pektin, Inulin und verschiedene Oligosaccharid- und Stärke abbauende Enzyme. Den Metatranskriptomdaten zufolge zeigten Cellulase, Hemicellulose und stärkeabbauende Enzyme eine erhöhte Aktivität in KBP und SZBP (Abb. 7B, C). Neben mehreren Unterschieden waren die Aktivitäten von Cellulasen (GH2 und GH3), Hemicellulasen (GH43 und GH18) und Stärke abbauenden Enzymen (GH97 und GH31) bei KBP und SZBP alle signifikant höher als bei MWBP (log2 FC: ≥2; p ≤ 0,05) (Abb. 7B und Ergänzungstabelle 5). Taxonomisch waren Mitglieder der Phyla Bacteroidota (die 46 % TPM der GHs ausmachen), Firmicutes G und Firmicutes A (12 % bzw. 7 % TPM der GHs) die dominanten Mitwirkenden der GH-Aktivität. Es wurde festgestellt, dass diese Phyla in vielen Biogas produzierenden Gemeinden die wichtigsten Polysaccharidabbauer sind [77, 95]. Dennoch deuten unsere Metatranskriptomdaten darauf hin, dass Mitglieder anderer Phyla wie Actinobacteriota (8 % TPM der GHs), Chloroflexota (4 % TPM der GHs) und Spirochaetota (5 % TPM der GHs) ebenfalls komplexe kohlenhydratabbauende Enzyme exprimierten (Abb. 7A) [29, 38]. Eine kombinierte quantitative Bewertung der Kohlenhydratbindungsmodule (CBM) und der GH-Aktivität ergab, dass die 30 wichtigsten hydrolysierenden nrMAGs über mehrere Phyla verteilt sind (Abb. 7C).

Unter den hochaktiven hydrolysierenden nrMAGs wurden acht Kern-nrMAGs nachgewiesen. Diese acht repräsentierten etwa 35 % der gesamten Top-Hydrolyse-Aktivität (Abb. 7C). Wir fanden heraus, dass UBA1179_sp002340405 (MAG_187_1) und Fermentimonas sp019136875 (MAG_96_1) zu Cluster I, UBA1402 sp002305085 (MAG_105_3) und Paludibacter sp012519425 (MAG_151_3) zu Cluster IV und SR-FBR-E9 gehören 9 sp009881065 (MAG_72_3) und W0P28-013 sp012837685 (MAG_251_2 ) zu Cluster VII. (Abb. 6B und 7C). Mitglieder der Top-Core-Hydrolyseure, die zu Cluster IV und I gehören, zeigten die am weitesten verbreiteten Wechselwirkungen (Abb. 6A). Diese Cluster waren direkt oder indirekt über IHT beteiligt und zeigten positive Assoziationen mit Methanoculleus bourgensis, Methanoculleus Species 1, Methanobacterium sp012838205 und Methanoculleus sp012797575 (Pearson-Rho 0,6–0,9). Allerdings zeigte der Cluster auch eine negative Korrelation mit Methanospirillum sp0125200015, Methanothrix sp016706325 und Methanoculleus sp002497965. Die letztgenannten hydrogenotropen und acetotrophen Methanogene, die zu IFT und DIET fähig sind, traten zusammen mit Cluster VII auf (Pearson-Rho < −0,6). Im Allgemeinen korrelierten die Konzentrationen von TAN, VOAs und TIC positiv mit den aktivsten kernhydrolysierenden nrMAGs in den Clustern I und IV (Pearson-Rho > 0,6). Allerdings gab es Ausnahmen, die Mikroorganismen des Clusters VII betrafen.

Um die methanproduzierende Nahrungskette weiter zu charakterisieren, führten wir eine Funktionsanalyse der nrMAGs durch, indem wir Metatranskriptomdaten und Daten aus der KEGG-Datenbank kombinierten (Abb. 8). Die Analyse der KEGG-Module zeigte, dass der Methanogeneseweg der aktivste unter allen Hauptwegen war (Mittelwert = 35 % TPM aller KEGG-Wege). Frühere Metagenomstudien haben die Methanogenese als „seltenes Modul“ in der Biogasproduktionsgemeinschaft angesehen [18, 29, 38] (Abb. 8A). Es ist wichtig anzumerken, dass die Methanogenese auf der Grundlage der Metagenomdaten tatsächlich ein seltenes Modul war, die Transkriptomdaten jedoch das Gegenteil vermuten ließen [95,96,97,98]. Vor diesem Hintergrund liefern Metatranskriptomanalysen, die die biologischen Aktivitäten von Mikroorganismen in komplexen Umgebungen quantifizieren, eine genauere Darstellung des mikrobiellen Lebens und der mikrobiellen Aktivität in der Gemeinschaft als Metagenomikstudien.

Eine Heatmap der aktivsten KEGG-Module. Dargestellt sind die 30 besten KEGG-Module aus allen zwölf Proben basierend auf metatranskriptomischen Daten (dargestellt in TPM). B Hauptkomponentenanalyse der Funktionsdaten des KEGG-Moduls. Jedes Symbol bezieht sich auf ein bestimmtes BP-Probenpaar. C Deutlich unterschiedliche methanogene Gene in den fünf aktivsten Methanogenen identifiziert. Dargestellt sind Unterschiede, die nach Berechnung durch DESeq2 als statistisch signifikant gelten (d. h. mit log2 FC > 2,0, p < 0,05). Die Wärmekarte zeigt die durchschnittliche Genaktivität jedes Methanogens in den verschiedenen BPs. Die Leerstellen stellen Gene dar, die sich im bereitgestellten Methanogen nicht signifikant unterschieden, oder das angegebene Gen fehlt im angegebenen nrMAG.

Wir identifizierten die Pyruvatoxidation, den Embden-Meyerhof-Weg und den Pentose-Phosphat-Weg als zentrale Module des Kohlenhydratstoffwechsels. Diese Pfade wurden in früheren metagenomischen Untersuchungen als „Kernmodule“ bezeichnet [29, 38]. Durch Hydrolyse entstehende Zucker können über den Embden-Meyerhof- und Pentose-Phosphat-Weg in Pyruvat umgewandelt werden, um CO2 und Elektronen zu erzeugen. Darüber hinaus sind der Acetyl-CoA-Weg, die Fettsäurebiosynthese und die Beta-Oxidation unter den 30 wichtigsten Wegen im Zusammenhang mit der Kohlenstofffixierung aktiv, wie bereits in mit Gülle ergänzten Reaktoren beobachtet wurde [29]. Dieses Ergebnis wurde durch die Identifizierung zahlreicher aktiver Module im Zusammenhang mit der Energie-, Aminosäure- und Cofaktorproduktion gestützt, die alle für ein gut funktionierendes Ökosystem zur Biogaserzeugung unerlässlich sind. Als nächstes entdeckten wir, dass KBP und SZBP eine ähnliche mikrobielle Zusammensetzung und ein ähnliches Funktionsprofil aufwiesen, während die von MWBP (basierend auf KEGG-Modulen) deutlich unterschiedlich zu sein schienen (Abb. 8B).

Um Expressionsmuster auf Transkriptebene zu bewerten, wurde eine differentielle Expressionsanalyse verwendet (siehe: „Statistische Analyse“). Mit dieser hochauflösenden Analyse konnten wir Veränderungen in 11.383 Genen der drei BPs feststellen (log2 FC > 2,0, p ≤ 0,05) (Ergänzungstabelle 5). Es wurde gezeigt, dass KBP und SZBP im Vergleich zu MWBP weniger differentiell exprimierte Gene (DEGs) enthalten (Abb. 8B und ergänzende Abb. 2). Eine umfassende Untersuchung von DEGs ergab, dass 215 Gene an der Methanogenese beteiligt sind. Die Aktivitäten der Alpha-, Beta- und Gamma-Untereinheiten der Methyl-Coenzym-M-Reduktase zeigten die deutlichsten Veränderungen (log2 FC > 10, p < 0,0001). Darüber hinaus wies die Expression von Genen, die an der hydrotrophen Methanogenese beteiligt sind, wie der Ionen-Schwefel-Untereinheit der F420-nichtreduzierenden Hydrogenase und der Methylentetrahydromethanopterin-Dehydrogenase, erhebliche Unterschiede auf (log2 FC > 5, p < 0,001). Acetyl-CoA-Synthetase zeigte Unterschiede in der Expression zwischen Genen, die an der acetotrophen Methanogenese beteiligt sind (log2 FC > 5, p < 0,001) [99]. Die meisten unterschiedlichen Genaktivitäten in KBP standen im Zusammenhang mit Methanothrix A harundinaceae D (MAG_5_1), während Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) in MWBP und Methanobacterium sp012838205, Methanoculleus sp12797575 und Methanosarcina-Arten (MAG_669_3, _57_1 und _165_3) in SZBP (Abb. 8C).

In einer komplexen Biogas-produzierenden Gemeinschaft nutzen methanogene Archaeen verschiedene Stoffwechselwege und Gensätze, um Methan zu produzieren, um Energie zu gewinnen und ihren Überfluss durch ihre Aktivität auszugleichen. Früheren Untersuchungen zufolge zeigte Methanococcus maripaludis unter wasserstofflimitierten Bedingungen erhöhte mRNA-Spiegel für Gene, die für Enzyme wie F420-nichtreduzierende Hydrogenase und Methylentetrahydromethanopterin-Dehydrogenase kodieren, was zu einer Erhöhung seiner Wachstumsrate führte [100]. Ähnliche Ergebnisse wurden in unserer Studie mit dem häufig vorkommenden Methanoculleus sp12797575 (MAG_57_1) in SZBP beobachtet. Diese Enzyme zeigten eine erhöhte Aktivität in diesem zu Cluster II gehörenden hydrotrophen Methanogen, das gleichzeitig mit den Hydrolyse-nrMAGs JAAZLA01 sp012799545 ​​und UBA1361 sp002306335 auftrat (Abb. 6A). Die erhöhte Expression der Formiatdehydrogenase weist darauf hin, dass MAG_57_1 Formiat als alternative Wasserstoffquelle nutzt (Abb. 8C), um seine methanogene Aktivität zu kompensieren. Diese Aktivität ist vergleichbar mit der mixotrophen Methanosarcina-Art, die häufig in SZBP vorkommt (die in der Lage ist, alle methanogenen Wege zu leiten, jedoch wurde in den Datenbanken GTDB und Biogas Microbiome kein Vertreter auf Artenebene identifiziert; MAG_165_3). Dies steht im Einklang mit den Erkenntnissen früherer Beobachtungen, dass die Stoffwechselvielfalt der methanogenen Gemeinschaft entscheidend für eine effiziente Biogasproduktion ist [74, 75].

In dieser Studie haben wir hochwertige nrMAGs (nicht redundante metagenomassemblierte Genome) rekonstruiert und eine präzise Metatranskriptomanalyse mithilfe eines Binning-Workflows für künstliche neuronale Netze an AD-Proben durchgeführt, die aus Biogasreaktoren im industriellen Maßstab entnommen wurden. Obwohl die drei BPs im industriellen Maßstab mit gut charakterisierten und unterschiedlichen Rohstoffen betrieben wurden, beobachteten wir im Beobachtungszeitraum keine Unterschiede in ihren jeweiligen Methanausbeuten. Die Mikrobiomzusammensetzung und das Funktionsrepertoire der KBP- und SZBP-BPs waren einander ähnlicher als bei MWBP. Als wichtige hydrolysierende Mikroorganismen wurden mehrere Bakterienstämme identifiziert. Eine signifikante Korrelation zwischen dem Kernmikrobiom und Fermentationsparametern wie TAN, VOAs und TIC legt nahe, dass das Interaktionsnetzwerk in der AD-Kernmikrobengemeinschaft durch verschiedene chemische Betriebsparameter beeinflusst wird. Hydrogenotrophe Methanogene (Archaea: Halobacteriota, Methanobacteriota) waren dominant und korrelierten positiv mit der Anwesenheit von Vertretern der Bakterienstämme Firmicutes und Bacteroidota, mit denen sie vielseitige Transfers zwischen den Arten eingehen. Auch in landwirtschaftlicher Biomasse und Abwasser wurden ausgeprägte Elektronentransfermechanismen gefunden, die von hydrotropen Methanogenen in der AD genutzt werden. Eine wichtige Archaeenart (Methanothrix sp016706325; MAG_97_2) wurde in der methanogenen Kerngemeinschaft entdeckt und spielt wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei der Gestaltung der mikrobiellen Strategie zur Methanproduktion. Unsere Studie ergab, dass die methanogenen Archaeen in drei Biogasanlagen im industriellen Maßstab trotz unterschiedlicher Betriebsbedingungen und gemessener Parameter eine ähnliche Gesamtaktivität aufrechterhielten. Das Vorhandensein einer Vielzahl methanogener Archaeen in Fermentern kann die Widerstandsfähigkeit der Gemeinschaft verbessern, indem es Redundanz und Funktionsstabilität bietet, was die entscheidende Rolle der Stoffwechselvielfalt bei der Gewährleistung einer effizienten Biogasproduktion unterstreicht. Dieses Ergebnis stimmte auch mit unseren BMP-Testmessungen überein. Die vorliegende Fallstudie bestätigt jedoch, dass es weiterhin erhebliche Wissenslücken in unserem Verständnis der Aktivitäten und Beziehungen zwischen den Arten zwischen Mitgliedern der Biogas produzierenden Gemeinschaften gibt. Diese Lücken können zumindest teilweise durch ein Framework geschlossen werden, das eine genomaufgelöste Metagenomanalyse mit einem parallelen Metatranskriptomik-Ansatz kombiniert, der von spezifischen Algorithmen des maschinellen Lernens, wie beispielsweise lebensraumspezifischen Modellen, geleitet wird.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten rohen Metagenom- und Metatranskriptomsequenzen wurden im NCBI SRA unter der Zugangsnummer PRJNA929705 hinterlegt. Hochwertige (vollständig >90 % Inhalt <5 %) nrMAGs sind im NCBI SRA unter den Zugangsnummern SAMN32989584 bis SAMN32989690 hinterlegt. Die wichtigsten für diese Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Workflows und R-Skripte sind auf begründete Anfrage beim Erstautor erhältlich.

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Roland Wirth konzipierte und führte die bioinformatischen Analysen durch und verfasste das Manuskript. Teur Teur Sally Cheung und Zoltán Bagi führten die Experimente durch und führten analytische Messungen durch. Prateek Shetty trug zu den Meta-Omics-Analysen bei. Kornél L. Kovács und Gergely Maróti entwarfen die Studie, verfassten das Manuskript und diskutierten die relevante Literatur. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Diese Studie wurde teilweise durch Projekte des Ungarischen Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsfonds (NRDIF) unterstützt: RW, BZ und GM erhielten Unterstützung von den Projekten PD132145, FK142500, FK123902, FK123899, K143198 und ÚNKP-22-5-SZTE-537 . Diese Arbeit wurde auch durch das Lendület-Programm (GM) und das Bolyai-Stipendium (WR) der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (LP2020-5/2020 und BO/00449/22) sowie durch das Széchenyi Plan Plus National Laboratory Program (Nationales Labor) unterstützt für Wasserwissenschaft und Wassersicherheit, RRF-2.3.1-21-2022-00008). BZ und KLK erhielten Unterstützung von 2020-3.1.2-ZFR-KVG-2020-00009 und 2019-2.1.13-TÉT_IN-2020-00016. Open-Access-Finanzierung durch ELKH Biological Research Center.

Institut für Pflanzenbiologie, Biologisches Forschungszentrum, Szeged, Ungarn

Roland Wirth, Prateek Shetty und Gergely Maróti

Abteilung für Biotechnologie, Universität Szeged, Szeged, Ungarn

Roland Wirth, Zoltán Bagi, Márk Szuhaj, Moderator Sally Cheung und Kornél L. Kovács

Fakultät für Wasserwissenschaften, Universität für öffentlichen Dienst, Baja, Ungarn

Gergely Maróti

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Korrespondenz mit Gergely Maróti.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 08. Februar 2023

Überarbeitet: 23. Mai 2023

Angenommen: 26. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01448-3

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