Menschliche Mikroglia zeigen einzigartige Transkriptionsveränderungen bei der Alzheimer-Krankheit

Nature Aging (2023)Diesen Artikel zitieren

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Mikroglia, die angeborenen Immunzellen des Gehirns, beeinflussen das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit (AD) und sind potenzielle therapeutische Ziele. Mikroglia weisen jedoch vielfältige Funktionen auf, deren Regulierung nicht vollständig verstanden ist, was die Entwicklung von Therapeutika erschwert. Um die transkriptomischen Phänotypen und Genregulationsnetzwerke im Zusammenhang mit AD besser zu definieren, haben wir vor der Einzelkern-RNA-Sequenzierung Mikroglia-Kerne aus dem Jahr 12 n. Chr. und 10 dorsolaterale präfrontale Kontrollkortizes des Menschen (7 Männer und 15 Frauen, alle > 60 Jahre alt) angereichert. Hier beschreiben wir sowohl etablierte als auch bisher nicht erkannte molekulare Mikroglia-Phänotypen, die abgeleiteten Gennetzwerke, die die beobachtete transkriptomische Veränderung vorantreiben, und wenden eine Trajektorienanalyse an, um die mutmaßlichen Beziehungen zwischen Mikroglia-Phänotypen aufzudecken. Wir identifizieren Mikroglia-Phänotypen, die in AD-Fällen im Vergleich zu Kontrollen häufiger vorkommen. Darüber hinaus beschreiben wir die Heterogenität in Mikroglia-Subclustern, die homöostatische Marker exprimieren. Unsere Studie zeigt, dass eine detaillierte Profilierung von Mikroglia im menschlichen AD-Gehirn Einblick in mikrogliale Transkriptionsveränderungen im Zusammenhang mit AD geben kann.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist pathologisch durch extrazelluläre Amyloid-beta (Aβ)-Plaques, neuronale intrazelluläre neurofibrilläre Knäuel und Neuroinflammation gekennzeichnet. Das Interesse an Neuroinflammation als modifizierbarem Merkmal der AD-Pathologie ist im Zusammenhang mit genetischen Studien zur Identifizierung von AD-Risikovarianten gewachsen, die in kodierenden und nicht-kodierenden Regionen von Genen lokalisiert sind, die ausschließlich von myeloischen Zellen des Gehirns exprimiert werden1. Mikroglia sind residente angeborene myeloische Immunzellen des Gehirns und tragen zu den neuroinflammatorischen Prozessen bei, von denen angenommen wird, dass sie die AD-Pathophysiologie fördern2,3,4,5,6,7,8,9,10. Frühere Studien legten nahe, dass Mikroglia bei AD Entzündungsmediatoren freisetzen, die das Verhalten und die Funktion der umgebenden Neuronen beeinflussen, und dass Glia neuroprotektive Funktionen verlieren und eine abnormale Phagozytose von Synapsen und Neuronen initiieren3,7,11,12. Mikroglia scheinen in Modellsystemen zur Tau-Ausbreitung beizutragen13,14 und sind wahrscheinlich der primäre Zelltyp, der an der Aβ-Entfernung beteiligt ist, einschließlich der Verringerung von Aβ, die als Reaktion auf antikörperbasierte Immuntherapieansätze beobachtet wird15. Daher ist das Entzündungsverhalten von Mikroglia für die Gestaltung therapeutischer Ziele relevant. Es bestehen jedoch weiterhin große Lücken in unserem Verständnis der Mikroglia-Reaktionen im AD-Gehirn.

Mikroglia-Phänotypen unterscheiden sich durch Morphologie, Physiologie und Gen- oder Proteinexpressionsmuster. In Modellsystemen durchgeführte Experimente legen nahe, dass diese heterogenen Merkmale wahrscheinlich mit spezifischen funktionellen Mikroglia-Phänotypen zusammenhängen10,16,17,18,19,20,21. Über die Heterogenität der Mikroglia-Phänotypen im erwachsenen menschlichen Gehirn ist weniger bekannt, insbesondere im Zusammenhang mit bestimmten Krankheitszuständen wie AD. Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierungsstudien (snRNA-seq) an frischem und gefrorenem menschlichem Kortikalisgewebe haben mehrere Mikroglia-Transkriptionsphänotypen im Zusammenhang mit AD und anderen Hirnpathologien ergeben22,23,24,25,26,27,28, 29. Die Unterscheidung transkriptomisch unterschiedlicher Cluster ermöglicht die Identifizierung potenzieller genetischer und epigenetischer Faktoren, die spezifische zelluläre Verhaltensweisen regulieren, die in präzisionstherapeutischen Ansätzen genutzt werden könnten. Standard-snRNA-seq-Methoden umfassen jedoch häufig eine geringe Anzahl von Mikroglia pro Person. Niedrige Zellzahlen können die Fähigkeit zur Kartierung des gesamten Spektrums mikroglialer Transkriptionsphänotypen beeinträchtigen und die Fähigkeit zur Identifizierung krankheitsbedingter Genexpressionsänderungen innerhalb eines Clusters oder Subclusters einschränken. Wir stellten die Hypothese auf, dass zusätzliche zelluläre Prozesse und regulatorische Faktoren der Transkriptionsphänotypen von Mikroglia durch die Verwendung von Datensätzen aufgedeckt werden könnten, die eine viel größere Anzahl von Mikroglia pro Einzelprobe enthalten.

Wir verwendeten fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) für PU.1 als Mikroglia-Anreicherungstechnik für snRNA-seq. Der myeloische Marker PU.1 wurde verwendet, um die Untersuchung der Epigenetik von Mikroglia mithilfe eines Assays auf Transposase-zugängliches Chromatin mithilfe von Sequenzierung zu verbessern30, und in der vorliegenden Studie wurde er auf die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) angewendet. Dieser Ansatz erleichterte die Erfassung von Einzelkern-Transkriptomprofilen von Tausenden von Mikroglia pro Proband. Wir haben Mikroglia-Transkriptionsprofile aus einer Kohorte von 22 Personen mit und ohne AD erstellt, was es uns ermöglichte, Mikroglia-Cluster mit plausiblen biologischen Rollen zu kommentieren und Unterschiede in den Mikroglia zwischen AD- und Kontrollpersonen zu identifizieren. Die große Anzahl an Profilen in diesem Datensatz ermöglichte es uns auch, AD-spezifische Subcluster innerhalb des Mikroglia-Clusters zu identifizieren, die aufgrund ihres Genexpressionsprofils typischerweise als „homöostatisch“ bezeichnet werden22,25,26,29. Zusätzlich zu den in früheren Berichten beschriebenen homöostatischen und entzündlichen Phänotypen haben wir Mikroglia-Phänotypen mit transkriptomischen Profilen entdeckt, die zusätzliche Einblicke in die AD-Pathogenese geben könnten. Diese Ergebnisse bieten neue Möglichkeiten für die Überprüfung von Hypothesen in zukünftigen Studien über die Rolle von Mikroglia bei AD.

Wir haben aus postmortalem menschlichem Gehirn isolierte Kerne auf Mikroglia angereichert, indem wir FANS für die Expression des myeloidspezifischen Transkriptionsfaktors PU.1 verwendet haben (Erweiterte Daten, Abb. 1a, b). Um zu bestätigen, dass PU.1 FANS wirksam war, isolierten und sequenzierten wir Kerne mit und ohne PU.1 FANS (n = 4). Wir analysierten eine ähnliche Anzahl von Gesamtkernen in den unsortierten (46.085; Extended Data Abb. 1c) und PU.1-sortierten (41.488; Extended Data Abb. 1d) Datensätzen. Der nach PU.1 sortierte Datensatz enthielt 20-mal mehr Mikroglia-Kerne, die durch eine hohe Expression von C3, CD74, C1QB, CX3CR1 und SPI1 definiert wurden (23.310 Mikroglia-Kerne), als der unsortierte Datensatz (1.032 Mikroglia-Kerne). Die im PU.1-sortierten Datensatz beobachteten Mikroglia-Kerne weisen auch eine weitere Komplexität auf, was durch mehr Mikroglia-Cluster belegt wird (Erweiterte Daten, Abb. 1d).

Als nächstes haben wir PU.1 FANS auf eine Kohorte von 22 Personen angewendet (Abb. 1a). Nach PU.1 FANS behalten die Proben eine Vielzahl nicht-myeloischer Zelltypen bei (Abb. 1b) und bieten gleichzeitig eine klare Auflösung von Clustern, die unterschiedliche Mikroglia-Genexpressionsmuster zeigen (63 % der Kerne; Abb. 1c). Der ursprüngliche Datensatz bestand aus 205.226 Kernen, wobei 200.948 Kerne (98 %) die Qualitätskontrolle und Dublettentfernung bestanden. Die Genexpression von Zelltyp-Markergenen zeigt, dass Cluster, die im Datensatz als Mikroglia (1, 2, 3, 7, 16 und 17; Abb. 1d) identifiziert wurden, eine hohe Expression von Mikroglia-Markern aufweisen und keine kanonischen Markergene anderer Zelltypen exprimieren . Somit wurden von den 200.948 Kernen 127.371 als Mikroglia identifiziert (Abb. 1d und Erweiterte Daten Abb. 2), mit einem Durchschnitt von 5.790 Kernen pro Person. Dieser Datensatz ist der größte bisher generierte Mikroglia-Datensatz pro Probe, auch im Vergleich zu anderen veröffentlichten Datensätzen, die alternative Anreicherungstechniken verwendet haben. Detaillierte Genexpressionsdiagramme sowohl von Mikroglia (Extended Data Abb. 2) als auch von Astrozyten- oder peripheren Monozytenmarkern (Extended Data Abb. 3) zeigen eine hohe Expression von Mikroglia-Genen im Mikroglia-Subset-Datensatz über alle Subcluster hinweg und das Fehlen anderer Zelltypen und Peripheriezellen Markierungen.

a, Experimentelles Design von 22 postmortalen menschlichen dorsolateralen präfrontalen Kortizes (teilweise erstellt mit BioRender). b: UMAP der PU.1-sortierten Kerne aus dem 22-Probanden-Datensatz zeigt, dass, obwohl andere Zelltypen, einschließlich Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten (Oligs) und ihre Vorläufer (OPCs) sowie Endothelzellen, vorhanden sind, sechs Cluster vorhanden sind , einschließlich der drei größten, bestehen aus Mikroglia-Kernen. c: Für Mikroglia (CX3CR1) werden repräsentative Zelltyp-Markergene (x-Achse) mit dem Prozentsatz der Kerne, die ein Gen exprimieren (Punktgröße), in jedem Cluster (verteilt entlang der y-Achse) und dem durchschnittlichen Expressionsniveau (Farbintensität) angezeigt , C1QB, CD74 und C3), Astrozyten (GFAP), Neuronen (MAP2), OPCs (COL20A1), Oligs (ST18) und Endothelzellen (ITIH5) für jeden Cluster. d: Die Genexpression eines größeren Satzes von Zelltyp-Markergenen zeigt, dass die Cluster 1, 2, 3, 7, 16 und 17 aus Mikroglia bestehen. IHC, Immunhistochemie.

Die Clusteranalyse der 127.371 Kerne mit Mikroglia-ähnlicher Expression identifizierte 10 Cluster (Abb. 2a), die durch differentiell exprimierte Gene (DEGs) gekennzeichnet sind, und verglich den Cluster mit allen anderen Kernen (Abb. 2b). Mithilfe der Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) haben wir die Anreicherung biologischer Signalwege in jedem Cluster bestimmt (Abb. 2c). Es gab kaum oder gar keine Überschneidungen bei den DEGs, die jeden Cluster definierten, oder bei den von GSEA identifizierten biologischen Pfaden, was die Einzigartigkeit jedes Clusters untermauerte.

a: UMAP der unvoreingenommenen Clusterbildung auf den Kernen aus den sechs PU.1-sortierten Clustern (1, 2, 3, 7, 16 und 17, dargestellt in Abb. 1d), die die Kriterien für Mikroglia aus dem 22-Proben-Datensatz erfüllen, enthält 10 Mikroglia-Cluster . b: Die differenzielle Expressionsanalyse, die jeden Cluster mit allen anderen Clustern vergleicht, zeigt unterschiedliche Genexpressionsprofile für jeden. Die 25 besten Gene aus jedem Cluster werden mit den auf der rechten Seite annotierten Gennamen angezeigt. Cluster 1 weist eine hohe Expression kanonischer Mikroglia-Gene (CX3CR1 und P2RY12) auf. c: Die GSEA-Analyse von Genen, die jeden Cluster von Cluster 1 unterscheiden („homöostatischer Marker“), legt unterschiedliche biologische Wege nahe. d: Kanonische Mikroglia-Marker-Genexpression im Mikroglia-Datensatz im Vergleich zu anderen Zelltypen, die während der PU.1-Anreicherung sortiert wurden, zeigt die Anreicherung der Mikroglia-Marker-Genexpression in den 10 Clustern. NES, normalisierter Anreicherungsscore.

Zunächst fanden wir Cluster mit Annotationen, die den zuvor im menschlichen Gehirn beschriebenen Mikroglia-Phänotypen ähneln. Wir identifizierten Cluster 1, den größten Cluster, als den Cluster, der mit homöostatischen Genen angereichert ist, einschließlich der hohen Expression von CX3CR1 und P2RY12 (Ref. 19, 24, 25, 26). Wir haben diesen homöostatischen Marker exprimierenden Cluster als „HM“ abgekürzt. HM wurde als Vergleichsbasis zur Bewertung von DEGs für andere Cluster etabliert und wiederholte den Ansatz in früheren Veröffentlichungen22,25,26 (Supplementary Data 1). Cluster 4 wurde hinsichtlich Signalwegen angereichert, die an der Apoptose, der Reaktion auf Interferon-Gamma (IFN-γ) sowie mitochondrialen und respiratorischen Funktionen beteiligt sind (Abb. 2c), einschließlich der KEGG-Signalwege bei Alzheimer, Parkinson und der Huntington-Krankheit. Der höchste DEG in diesem Cluster ist FTL. Zusammengenommen lässt das Profil von Cluster 4 auf einen degenerativen oder dystrophischen Phänotyp schließen12,26. Cluster 7 war durch die Expression von Genen gekennzeichnet, die an Migration und Motilität beteiligt sind (Abb. 2b). Zu den in Cluster 7 angereicherten Signalwegen gehörten Membranorganisation und Motilität (Abb. 2c). Cluster 8 wies einen kanonischen Entzündungsphänotyp mit der Expression klassischer Entzündungsaktivierungsgene auf, darunter NFκB1, RELB und IL1β (Abb. 2b)2,31,32. GSEA ergab, dass dieser Cluster mit NFκB-Signalen, Interferon-Signalen, Toll-like-Rezeptor (TLR)-Signalen und RIG-I-vermittelten Signalwegen angereichert war, was auf nachgeschaltete Effektor-Entzündungsreaktionen auf Reize hinweist (Abb. 2c). Zu den weiteren mit Cluster 8 verbundenen Begriffen der Genontologie (GO) gehörten Lipidsynthese und -lokalisierung. Cluster 9 wird durch Gene und Wege definiert, die an Seneszenz, Eisenhomöostase und Zytokinproduktion beteiligt sind (Abb. 2b), einschließlich CDKN1A, CEBPB, ZFP36 und FTL33. Dieses Profil lässt auf seneszente Mikroglia schließen34. Cluster 10 wird durch die Expression von Genen definiert, die an der Regulierung des Zellzyklus und der DNA-Reparatur beteiligt sind35,36 (Abb. 2b). Die in Cluster 10 angereicherten Signalwege bestätigen die relative Zunahme der an Zellzyklusprozessen beteiligten Gene und eine Abnahme der Endosomen- und Zytokinverarbeitungsgene (Abb. 2c). Wie für Mikroglia unterschiedlicher aktivierter und nicht aktivierter Phänotypen erwartet, variierte die Expression von Genen wie P2RY12, wohingegen Mikroglia-Gene wie C3 und CD74 in den Mikroglia-Subclustern eine ähnlichere Darstellung aufwiesen (Abb. 2d).

Als nächstes fanden wir drei Cluster, Cluster 3, 5 und 6, die bisher im menschlichen Gehirn nicht beschrieben wurden. Diese Cluster zeichneten sich durch ihre Genexpression im endolysosomalen Netzwerk (ELN) und die Anreicherung der ELN-Signalwegsignaturen im Vergleich zu HM-Mikroglia aus. Wir kommentieren sie daher gemeinsam als ELN. Cluster 3 wird durch Gene definiert, die an der Internalisierung aggregierter Proteine ​​beteiligt sind (Abb. 2b)19,20,24,25,26,37 Phagozytose und Vesikel-vermittelter Transport32. Zu den in Cluster 3 angereicherten Pfaden gehören Endosomen- und Lysosomenpfade sowie Katabolismus und Lipidbindung, jedoch keine entzündlichen Prozesse (Abb. 2c). Gene, die an der Glykolyse beteiligt sind, weisen in Cluster 3 eine geringere Expression auf, was ihn von den beiden anderen ELN-Clustern unterscheidet, was darauf hindeutet, dass diese Zellen nicht die metabolische Umstellung auf Glykolyse durchlaufen haben, die beim Mikroglia-Entzündungsphänotyp beobachtet wird38. Die Cluster 5 und 6 zeigten eine ELN-Signatur, obwohl sie auch metabolisch aktiv zu sein schienen und deutliche Entzündungsmerkmale aufwiesen. Cluster 5 wies zusätzlich zu anderen Hitzeschockproteingenen eine erhöhte Expression von HSP90AA1, HIF1A und BAG3 auf (Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass diese Zellen auf externen Stress reagieren. Gene, die die Glykolyse antreiben, waren in Cluster 5 im Vergleich zu HM ebenfalls höher, was möglicherweise auf einen Wechsel zur Glykolyse in diesen Zellen zurückzuführen ist38. Die in diesem Cluster angereicherten Signalwege weisen darauf hin, dass er bei Endozytose, Autophagie und Mitophagie aktiv ist (Abb. 2c). Cluster 6 ist durch Stoffwechselaktivitätsgene und Stressreaktionswege ähnlich wie Cluster 5 gekennzeichnet (Abb. 2c), allerdings mit einer zusätzlichen Komponente der Interferonsignalisierung, die durch deutlich höhere Werte von IRF3, IRF5 und IRF7 nahegelegt wird. Cluster 6 zeigte auch eine erhöhte Expression zytosolischer DNA/RNA-Erkennungs- und antiviraler Gene, einschließlich IFIT2, IFIT3 und TRIM22 (Lit. 39), sowie des Mustererkennungsrezeptors CARD9 und Mediatoren des NLRP3-Inflammasoms31,32,40,41,42 ,43. Bemerkenswert ist, dass wir nur für Cluster 6 festgestellt haben, dass die DNA-Reparaturgene ATM und RNASEH2B eine geringere Expression aufwiesen. Während IL1β in Cluster 6 im Vergleich zu HM erhöht war, wurden in Cluster 8, dem kanonischeren „inflammatorischen“ Cluster, sogar noch höhere IL1β-Spiegel und die Expression anderer entzündlicher Effektormoleküle wie NFkB1 gefunden. In Cluster 6 angereicherte Signalwege unterstützen auch vorgeschaltete Entzündungsreaktionen auf gefahrenassoziierte molekulare Musterreize, wie z. B. die Anreicherung der NOD-like-Rezeptor (NLR)-Signalübertragung. Darüber hinaus verwendeten wir alternative Methoden, um biologische Pfade und die Verbindungen zwischen ihnen zu identifizieren und so die ELN-Funktionen der Cluster 3, 5 und 6 zu validieren (Erweiterte Daten, Abb. 4). Ergänzende Tabellen mit den Genen, die die Präsenz jedes Knotens im Netzwerk steuern, sind auf Synapse verfügbar.

Trotz der Rolle von APOE für das Risiko und die Progression von AD44 gibt es bisher keine Studien, die Mikroglia-Zustände bei Personen mit einem bestimmten APOE-Genotyp definieren. Da die meisten (13/22) unserer Proben homozygot für das APOE-ε3-Allel waren, haben wir eine Teilmenge unseres Datensatzes erstellt, die vollständig aus APOE-ε3/ε3-Individuen bestand (sieben Kontrollen und sechs AD-Pathologien, neun Frauen und vier Männer; 75.018 Mikroglia). Kerne). Nach der Neunormalisierung und Neugruppierung identifizierten wir neun Mikroglia-Cluster (Extended Data Abb. 5a). Diese Cluster wurden durch Gene definiert, die denen ähnelten, die die Cluster im gemischten APOE-Genotyp-Datensatz definierten (erweiterte Daten, Abb. 5b und ergänzende Daten 2). Wir fanden heraus, dass die DEGs in den meisten Clustern denen im gemischten APOE-Datensatz (erweiterte Daten, Abb. 5c) sehr ähnlich waren (~60 % oder mehr Übereinstimmung). Die HM-, neurodegenerativen, entzündlichen, Zellzyklus- und endolysosomalen Cluster ähnelten denen der gemischten APOE-Kohorte. Dies deutet darauf hin, dass das Vorhandensein mehrerer unterschiedlicher ELN-Mikroglia-Cluster im menschlichen Gehirn häufig vorkommt, selbst wenn der APOE-Genotyp kontrolliert wird.

Um die regulatorischen Netzwerke der Populationen im Datensatz zu charakterisieren, haben wir die wichtigsten Transkriptionsfaktor-gesteuerten Netzwerke (Regulons) identifiziert, die die Genexpression in jedem der Mikroglia-Cluster steuern (Abb. 3). Jeder Cluster wird durch einen spezifischen Satz von Regulons definiert (Abb. 3a), was die Hypothese stützt, dass die unterschiedliche Genexpression, die jeden Cluster charakterisiert, durch Mechanismen der Transkriptionsregulation bestimmt wird. Um die Vielfalt der Regulons zu demonstrieren, die voraussichtlich die Genexpression in verschiedenen Clustern steuern, heben wir Cluster 3, Cluster 5, Cluster 6 und Cluster 8 hervor (Abb. 3b). Jeder dieser Cluster zeigt einen anderen Satz von Regulons, die in den Permutationen der Analyse wiederholt als einer der Top 10 für diesen Cluster erscheinen. Beispielsweise hat Cluster 5 einen glykolytischen und endolysosomalen Phänotyp mit Cluster 6 gemeinsam, jedoch nicht die für Cluster 6 vorhergesagten Interferon-Response-Faktor-Regulone. Während wir außerdem IRF1- und NFKB2-Regulone in Cluster 8, dem kanonischen „inflammatorischen“ Effektorcluster, beobachteten, Wir beobachteten zusätzliche (und unterschiedliche) Interferon-Response-Faktor-Regulons in Cluster 6. Die Top-Regulons für andere Cluster unterscheiden sich ebenfalls voneinander (Extended Data Abb. 6). MAFB, ein Transkriptionsfaktor, der mit der entzündungshemmenden Genregulation assoziiert ist, stand in Cluster 3 ganz oben auf der Liste (Lit. 16). Im Gegensatz dazu standen Regulone, die durch Transkriptionsfaktoren gesteuert werden, die typischerweise mit antiviralen Reaktionen verbunden sind, IRF7 und in geringerem Maße IRF3, in Cluster 6 ganz oben auf der Liste, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass diese Zellen auch für die Nukleinsäureerkennung und endolysosomale Signalwege angereichert sind ( Abb. 3b). Die Top-Regulons für die APOE ε3/ε3-Untergruppe von Individuen weisen eine ähnliche einzigartige Diversität auf wie die im größeren Datensatz beschriebenen, was wiederum auf eine Homologie zwischen den APOE-Genotypen hindeutet (Erweiterte Daten, Abb. 7). Zusammengenommen veranschaulichen diese abgeleiteten Gennetzwerke und ihre Transkriptionsfaktor-Regulons die Vielfalt der hier identifizierten Cluster und bieten potenzielle regulatorische Ziele für zukünftige Studien.

a: Der SCENIC-Workflow identifizierte durch Transkriptionsfaktoren regulierte Netzwerke, die mit verschiedenen phänotypischen Mikroglia-Clustern assoziiert sind. Wärmekarte der Fläche unter der Kurve (AUC) des Transkriptionsfaktors (Regulonaktivität in Clustern). b, Prozentsatz der Fälle, in denen Transkriptionsfaktor-Regulone in den Top 10 der Regulon-Spezifitätswerte pro Cluster auftraten (von 27 Permutationen). Eine dunklere Farbe weist auf einen höheren Prozentsatz der Replikation hin.

Experimente in Modellsystemen mit definierten Reizen haben das Potenzial von Mikroglia gezeigt, verschiedene Phänotypen zu erwerben. Es ist jedoch eine Herausforderung, die Progression und die phänotypischen Veränderungen zu verstehen, die menschliche Mikroglia in vivo hervorrufen. Wir verwendeten unseren Einzelkerndatensatz, um transkriptomische Übergänge von Mikroglia mithilfe der Trajektorieninferenzmethode Monocle3 (Lit. 45) zu untersuchen (Abb. 4). Als hypothesengenerierende Übung haben wir gefragt, welcher Cluster ein Endzustand oder ein Übergangszustand sein könnte. Die resultierenden Verzweigungstrajektorien legen nahe, dass mehrere Übergangszustände von HM ausgehen, dem Cluster, der für die homöostatische Genexpression angereichert ist, was die Hypothese stützt, dass „homöostatische“ Mikroglia beim Menschen zu mehreren Endpunktphänotypen übergehen können, wie in Modellstudien vorhergesagt10,16,17. Wir fanden Beziehungen zwischen Clustern, die bei der alleinigen Untersuchung von DEGs und GSEA nicht sofort erkennbar waren. Die Trajektorienanalyse ergab einen Verzweigungspunkt, an dem sich die Zellprogression entweder zum autophagischen Stress-ELN-Cluster (Cluster 5) oder zum entzündlichen ELN-Cluster (Cluster 6) fortsetzt (Abb. 4). Cluster 5 grenzt an den seneszenzähnlichen Cluster (Cluster 9) an, was mit der Annahme übereinstimmt, dass Autophagie und Seneszenz verwandte biologische Wege und Endpunkte sind. Ähnlich wie bei der Arbeit von Nguyen et al.26 ist der bewegliche Cluster (Cluster 7) ein weiterer Endpunkt.

Die auf den Mikroglia-Datensatz angewendete Monokel-Trajektorieninferenz zeigt, dass mehrere phänotypische Optionen von Cluster 1 nach außen ausgehen. Jeder Zweig hat mehrere potenzielle Endpunkte, was darauf hindeutet, dass Mikroglia möglicherweise nicht entlang einer einzelnen abgestuften linearen Trajektorie fortschreiten, sondern stattdessen einen von mehreren Übergangszuständen durchlaufen erreichen verschiedene transkriptomische Endphänotypen.

Sowohl homöostatische Marker exprimierende als auch kanonische Entzündungscluster (HM bzw. Cluster 8) waren sowohl im AD- als auch im Kontrollgehirn gleichermaßen vertreten. Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass Cluster 6 mehr AD-Kerne aufwies, als in unserem Datensatz zu erwarten wäre (angepasstes P = 0,006), was darauf hindeutet, dass AD-relevante Prozesse im Profil dieses Clusters dargestellt sein könnten (Abb. 5a). In mehreren genomweiten AD-Assoziationsstudien wurden Risikoallele identifiziert, die mit Genen assoziiert sind, die in Mikroglia oder myeloischen Zellen exprimiert werden4. Anhand einer Liste von 46 Genen in Einzelnukleotid-Polymorphismus-Loci, die mit einem veränderten AD-Risiko assoziiert sind44,46, verwendeten wir GSEA, um die Anreicherung dieser Gene in den 10 identifizierten Mikroglia-Clustern zu bewerten. Wir beobachteten, dass in Cluster 6 (Abb. 5b) im Vergleich zu allen anderen Clustern mehr AD-Risikogene unterschiedlich exprimiert werden (angepasstes P <0, 001). Die Genexpression von PICALM, SORL1 und PLCG2 war in Cluster 6 im Vergleich zu den übrigen Clustern signifikant geringer, wohingegen die Expression anderer Gene, einschließlich APP, APOE und BIN1, signifikant höher war (alle angepasstes P <0, 001; Abb. 5b). Unter Verwendung eines alternativen Satzes von ELN-Genen zeigen wir eine signifikante unterschiedliche Expression in Cluster 6, wohingegen TLR-assoziierte Gene in Cluster 8 häufiger stark exprimiert wurden (Extended Data Abb. 8a, b). Mit „krankheitsassoziierten Mikroglia“ assoziierte Gene wurden über mehrere Cluster hinweg angereichert, im Gegensatz zu einem einzelnen Cluster, der in AD-Mausmodellen beobachtet wurde19 (Extended Data Abb. 8c). Wir untersuchten weiter, ob ein beim gesunden Altern vorhandener Mikroglia-Phänotyp im AD-Gehirn reduziert war. Wir haben festgestellt, dass Cluster 10, der Cluster, der Zellzyklus-regulatorische Gene unterschiedlich exprimiert, im Kontrollhirn größer ist als im AD-Gehirn (gemischtes APOE-bereinigtes P < 0,001 und APOE ε3/ε3-bereinigtes P < 0,001; Abb. 5a). Cluster 10 ist der kleinste Cluster in unserem Datensatz und verdient daher eine Replikation; Diese Daten deuten jedoch darauf hin, dass die AD-Pathologie eine nachweisbare Verringerung eines Mikroglia-Clusters beinhalten könnte, der mit Zellzyklus- und DNA-Reparaturgenen angereichert ist.

a: Cluster 6 ist im AD-Gehirn signifikant erhöht (Chi-Quadrat-FDR-korrigierter P = 0,0064), wohingegen Cluster 10 in Kontrollproben (Strg) erhöht ist (Chi-Quadrat-FDR-korrigierter P = 0,0006). b, Wärmekarte der AD-assoziierten Risikogenexpression über Mikroglia-Cluster hinweg zeigt eine stärkere unterschiedliche Expression in Cluster 6. c, Demonstration der Heterogenität der Lysosomenmorphologie in Mikroglia. Repräsentative Bilder eines AD-Falls zeigen Mikroglia (Iba-1, grün) mit Heterogenität in der Morphologie und im Lamp-1-Signal. Beispiele hierfür sind ein verzweigtes (oberer Pfeil) und größeres Lysosomensignal (Lamp-1, Magenta) sowie ein „aktivierter“ oder weniger verzweigter Phänotyp (unterer Pfeil). d: Repräsentative Mikroglia (Iba-1, grün) mit hoher PTGDS-Expression (rot), ein Cluster-6-Marker in einem AD-Fall. e: Repräsentative Mikroglia (Iba-1, grün) mit hoher Expression von P2RX7 (Magenta), einem Cluster-6-Marker in einem AD-Fall. f, Ein repräsentatives Beispiel für aktivierte Mikroglia mit einer großen Anzahl von Lysosomen (Lamp-1, weiß) und zytosolischer dsDNA (magenta) in einem AD-Fall. Alle repräsentativen Bilder in c–f zeigen eine in mehreren Feldern und mindestens drei menschlichen Gehirnen replizierte Färbung. Alle Maßstabsbalken repräsentieren 15 µm. **Korrigiertes P < 0,01.

Die transkriptomischen Daten sagen eine Heterogenität der endolysosomalen Mikroglia-Phänotypen sowohl bei älteren Kontrollpersonen als auch bei AD-Gehirnen voraus. Die Immunfärbung für LAMP1, einen lysosomalen Marker, ergab ein Spektrum lysosomaler Phänotypen mit unterschiedlicher lysosomaler Größe und Anzahl (Abb. 5c). Mikroglia, die Cluster-6-Marker exprimieren, wurden im AD-Gehirn durch Immunmarkierung der Proteinprodukte von PTGDS (Abb. 5d) und P2RX7 (Abb. 5e) identifiziert, beides stark exprimierte Gene in diesem Subcluster. Cluster 6 und Cluster 8 Mikroglia zeigen beide eine unterschiedliche Expression von Genen, die am Nachweis von DNA/RNA-Molekülen beteiligt sind, was darauf hindeutet, dass Mikroglia durch Exposition gegenüber zytosolischen Nukleinsäuren aktiviert werden könnten. Um das Vorhandensein zytosolischer Nukleinsäuren in Mikroglia zu beurteilen, haben wir Mikroglia für doppelsträngige DNA (dsDNA) immunmarkiert (Abb. 5d). Wir beobachteten, dass Mikroglia mit Immunreaktivität für dsDNA auch vergrößerte Lysosomen enthielten, wohingegen andere Mikroglia im gleichen Gewebeabschnitt eine normale Lysosomengröße und keine Immunreaktivität für dsDNA aufwiesen (Extended Data, Abb. 9). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch Genexpressionsmuster widergespiegelte Mikroglia-Heterogenität morphologische Phänotypen darstellen könnte, die im menschlichen Gewebe nachgewiesen werden können.

Wir kamen zu dem Schluss, dass es angesichts der bekannten entzündlichen Veränderungen im Zusammenhang mit molekularen Profilen des menschlichen Gehirns schwierig sein könnte, AD-spezifische Signaturen zu erkennen, wenn polarisierte Subpopulationen in AD und gealtertem Hirngewebe untersucht werden. Wir haben unsere Aufmerksamkeit auf die Komplexität innerhalb von HM gerichtet. Wie bereits berichtet, haben wir beobachtet, dass HM die größte Population darstellt und in AD- und älteren Kontrollhirnproben verhältnismäßig ähnlich ist22,25,26. Diese Population wurde nicht ausführlich charakterisiert, um den Einfluss von AD auf die Genexpression in homöostatischen Mikroglia zu verstehen. Unser Datensatz untersuchte über 50.000 Mikroglia, die mit homöostatischen Markern angereichert waren, und ermöglichte den Nachweis von Subclustern innerhalb der HM-Mikroglia-Population. Die Subclusterung von HM-Mikroglia ergab sieben Populationen mit unterschiedlicher Genexpression (Abb. 6a). Wir fanden heraus, dass es im Gegensatz zum größeren Mikroglia-Datensatz einen Subcluster gab, der nahezu nur bei AD-Fällen vorkam. Dieser AD-spezifische Mikroglia-Subcluster, Subcluster 1.5 (Abb. 6b), bestand fast ausschließlich aus AD-Mikroglia, was darauf hindeutet, dass er möglicherweise ausschließlich auf die AD-Pathologie zurückzuführen ist (angepasstes P <0, 001). Im Gegensatz dazu war Subcluster 1.4 durch Kontrollkerne überrepräsentiert (Abb. 6b; angepasstes P <0, 05). HM-Subcluster zeigten eine hohe Expression von P2RY12, mit der höchsten Expression in Subcluster 1.5 (Abb. 6c). Andere Genexpressionsmarker des HM-Subclusters 1.5 waren spezifischer, einschließlich der DEGs WIPF3, PDE4B und KCNIP (Abb. 6c). Um mit der Charakterisierung der mutmaßlichen biologischen Prozesse zu beginnen, die in diesen Subclustern vertreten sind, haben wir die GSEA wie oben beschrieben durchgeführt. Subcluster 1.5 wies ein einzigartiges Anreicherungsprofil für Gene auf, die an der Zellmotilität und der Kalziumsignalisierung beteiligt sind (Abb. 6d). Mithilfe der Immunhistochemie haben wir das Vorhandensein einer doppelt positiven, hohen P2RY12- und PDE4B-Proteinexpression in Mikroglia im menschlichen AD-Gehirn validiert (Abb. 6e). Wir haben diese Ergebnisse zusätzlich in unserer Kohorte aller APOE ε3/ε3-Individuen überprüft. Wir bestätigten erneut, dass der für die homöostatische Genexpression angereicherte Mikroglia-Cluster in mehrere Populationen mit unterschiedlicher Genexpression aufgeteilt werden konnte und dass ein solcher Cluster in AD-Fällen angereichert war (Extended Data, Abb. 10).

a: Die Subclusterung von Cluster-1-homöostatischen Marker-Mikroglia (HM) ergab sieben Subpopulationen, die durch unterschiedliche Genexpression definiert wurden. b: Subcluster 1.5 ist in AD-Gehirnproben stark erweitert (Chi-Quadrat-FDR-korrigiertes P = 6,2936 × 10−13), wohingegen Subcluster 1.4 in Kontrollhirnproben (Strg) erhöht ist (Chi-Quadrat-FDR-korrigiertes P = 0,0194). . c: Die Genexpression von P2RY12 zeigt eine hohe Expression in allen HM-Subclustern, mit der höchsten Expression in Subcluster 1.5. Im Subcluster 1.5 unterschiedlich exprimierte Gene wie WIPF3, PDE4B und KCNIP weisen ebenfalls eine hohe Expression auf. d: Die Pathway-Anreicherung in Subcluster 1.5 zeigt eine einzigartige Anreicherung für Motilität, Ionenkanalaktivität und neuronenbezogene Prozesse. e, Immunhistochemie validiert das Vorhandensein von doppelt positiven, stark P2RY12-exprimierenden und PDE4B-exprimierenden Mikroglia im AD-Gehirn. Repräsentative Bilder zeigen die in mehreren Feldern und mindestens drei menschlichen Gehirnen replizierte Färbung. Maßstabsbalken, 25 µm. *Korrigiertes P < 0,05; **korrigiertes P < 0,01. Reg., Verordnung.

Diese Studie identifizierte 10 verschiedene Mikroglia-Cluster aus gealtertem menschlichen Gehirn. Dazu gehörten zuvor beschriebene homöostatische, seneszierende und entzündliche Mikroglia-Transkriptionsphänotypen sowie zusätzliche Cluster von Transkriptionsspezifikationen, die Einblicke in die AD-Pathogenese geben und eine Plattform für die Erstellung von Hypothesen bieten könnten. Wir beschreiben die Vielfalt von Mikroglia-Clustern mit endolysosomalen Gensignaturen, von denen einer mit Genen zur Nukleinsäureerkennung und Interferonregulation angereichert ist. Abgeleitete Gennetzwerke sagen voraus, dass einzelne Cluster durch unterschiedliche Transkriptionsfaktoren gesteuert werden, was die funktionelle Vielfalt von Clustern weiter stützt. Mithilfe der Trajektorieninferenzanalyse beobachteten wir Übergänge in Mikroglia-Phänotypen und sagten Beziehungen voraus, die experimentell getestet werden können. AD-Fälle zeichneten sich durch die Entstehung eines Subclusters aus, der homöostatische Gene exprimierte (Subcluster 1.5), der durch eine veränderte Transkription von Genen gekennzeichnet war, die an der Kalziumaktivierung, der Reaktion auf Verletzungen und den Motilitätswegen beteiligt sind.

Die endolysosomale Funktion ist für den Transport und Abbau pathologischer Proteine ​​von entscheidender Bedeutung, und eine Funktionsstörung des ELN ist an der AD-Pathogenese beteiligt. Über die Auswirkungen der ELN-Dysfunktion speziell bei AD-Mikroglia ist weniger bekannt47. Diese Studie identifizierte drei Mikroglia-Cluster, Cluster 3, 5 und 6, die sich durch die Expression von ELN-Komponenten unterscheiden und jeweils ein bestimmtes Muster der Endozytose, des Vesikeltransports sowie der Genexpression des endolysosomalen und autophagosomen Signalwegs aufweisen. Es wird angenommen, dass eine beeinträchtigte mikrogliale endolysosomale Funktion durch unzureichende Amyloid-Clearance zur AD-Pathogenese beiträgt1,47. Allerdings spielt das ELN in myeloischen Zellen auch eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung und Verarbeitung fremder Mikroben, einschließlich der Auslösung von TLR- und Interferon-Signalen31,48. Die Genexpression in Cluster 6 (der in AD-Fällen überrepräsentierte Subtyp) war durch eine Anreicherung der Expression von Genen gekennzeichnet, die an der lysosomalen und vesikulären Funktion beteiligt sind, und eine gleichzeitig erhöhte Expression des Interferon-Regulationsfaktors und der Inflammasom-Aktivierungsgene40,42,49,50. Obwohl es bei menschlicher AD keinen einzigen „DAM“-Phänotyp gibt, haben wir einen Typ-1-Interferon-Antwortcluster beobachtet, der sich von einem dystrophischen oder kanonischen entzündlichen Phänotyp unterscheidet18,19,37,51. Wir gehen davon aus, dass die IRF-Expression hier die Exposition gegenüber mit Gefahren verbundenen molekularen Mustermolekülen, einschließlich Nukleinsäuren aus Mikroglia oder benachbarten Zellen, widerspiegeln könnte. Diese Hypothese wird durch unsere Beobachtung von Mikroglia mit Immunreaktivität gegenüber zytosolischer dsDNA und amöboider Morphologie gestützt (Abb. 5). Diese Ergebnisse stimmen mit Studien an Mäusen und In-vitro-Studien überein, die zeigen, dass Amyloidfibrillen Nukleinsäuren enthalten und in Mikroglia eine Typ-I-Interferonreaktion auslösen, die zum Verlust der Synapse führt50. Song et al.49,52 berichteten über eine Schlüsselrolle des ELN beim Abbau von Nukleinsäuren und der Interferon-Reaktion auf DNA-Schäden nach Freisetzung von Kern-DNA in das Zytosol, was mit dem hier beschriebenen Phänotyp übereinstimmt. Cluster-6-Mikroglia waren bei AD-Fällen nicht nur als Population erhöht, sondern zeigten auch eine signifikante unterschiedliche Expression einer Reihe von Genen, die mit dem genetischen Risiko für AD verbunden sind (Abb. 5). Diese Beobachtung stützt die Hypothese, dass entzündliche Zelldysfunktionen einen wichtigen Beitrag zum AD-Risiko leisten, und legt nahe, dass der durch Cluster 6 dargestellte Mikroglia-Subtyp ein Mikroglia-Subtyp sein könnte, auf den therapeutische Interventionen abzielen.

Wir haben unseren Datensatz genutzt, um Trajektorienmethoden anzuwenden, um die möglichen Beziehungen zwischen mikroglialen Transkriptionsphänotypen abzuleiten. Dystrophische (Cluster 4) und seneszierende (Cluster 9) Cluster treten als „Endzustände“ auf und zeigen, wie rechnerische Trajektorieninferenz mikrogliale Phänotypen im Einklang mit Vorhersagen aus früheren empirischen Daten abbilden kann10,16,17. Dennoch sollten diese Ergebnisse, wie bei allen bioinformatischen Analysen, als hypothesengenerierend angesehen werden. Die Trajektorienanalyse zeigte auch, dass die autophagischen Stress- und entzündlichen ELN-Cluster (Cluster 5 bzw. Cluster 6) einen Verzweigungspunkt von Cluster 1 darstellten. Alternativ schien Cluster 3 eine Übergangsphase zwischen dem homöostatischen Cluster und entweder den beweglichen oder dystrophischen Clustern zu sein . Diese Ergebnisse ähneln einem früheren Bericht von Nguyen et al.26. Unsere Analyse nominiert genetische Regulatoren jedes Clusters, und zusammen können diese Daten als Leitfaden für weitere Studien verwendet werden, um die Plastizität oder Reversibilität des Mikroglia-Phänotyps zu testen53. Darüber hinaus ist es im Gegensatz zu anderen Zelltypen, die terminal differenziert sind, plausibel, dass Mikroglia in und aus transkriptomischen Zuständen übergehen können, was den „Schnappschuss“-Charakter der Gewebe-Omics unterstreicht.

Wir haben einen AD-spezifischen Mikroglia-Phänotyp, Subcluster 1.5, innerhalb des Homöostatika-Marker-exprimierenden Clusters, Cluster 1, entdeckt. Der Spitzname „homöostatisch“ wird oft verwendet, um einen Cluster zu beschreiben, der Gene exprimiert, die aufgrund ihrer verminderten Expression bei Mikroglia-Aktivierung als homöostatisch bezeichnet werden. Ob diese Gene wirklich eine aktive Rolle dabei spielen, eine aktivierte oder verletzte Zelle dazu zu bringen, einen weniger reaktiven Zustand wieder aufzunehmen, oder einen bestimmten Zustand aufrechtzuerhalten, ist unbekannt. Dennoch stellten wir fest, dass der Cluster, der anhand der typischen homöostatischen Marker als „homöostatisch“ identifiziert wurde, auf eine Komplexität der Mikroglia-Profile hinweist, die möglicherweise Hinweise auf frühe oder subtile Mikroglia-Veränderungen als Reaktion auf die AD-Pathologie enthalten. Beispielsweise zeigt Subcluster 1.5 die höchste Expression von P2RY12 sowie die Expression von Genen, die auf eine andere Aktivitätsebene schließen lassen. Bemerkenswert ist, dass P2RY12 mit aktiven Mikroglia-Phänotypen assoziiert ist und als wesentlich für die Anfangsstadien der Motilität während einer Entzündung angesehen wird54. Das am stärksten differenziell regulierte Gen in Subcluster 1.5 ist PDE4b, eine Phosphodiesterase, die an der kognitiven Funktion55 und der Entzündungsaktivierung myeloider Zellen beteiligt ist56,57. PDE4b reguliert den cAMP-Spiegel, der nachweislich das Mikroglia-Überwachungsverhalten moduliert58. Subcluster 1.5 zeigt auch eine Anreicherung der Motilitäts- und Kalzium-Signalwege, was auf eine Reaktion auf neuronale Aktivität oder eine Erweiterung mikroglialer Prozesse hinweisen könnte53. Daher spekulieren wir, dass Subcluster 1.5 frühe oder subtile Veränderungen des Mikroglia-Phänotyps als Reaktion auf pathologisches Protein darstellen könnte, jedoch keinen vollständig immunologisch aktivierten Phänotyp.

Wie bei allen snRNA-seq-Studien gibt es auch bei unserer Studie Einschränkungen. Obwohl die PU.1-Sortierung eine Möglichkeit bietet, Mikroglia-Kerne zu vergrößern und so eine bessere Auflösung von Phänotypen auf der Ebene einzelner Probanden zu erreichen, selektiert sie möglicherweise eine bestimmte Mikroglia-Population. Obwohl bekannte mikrogliale und periphere myeloische Marker, die zur Annotation von Zellen verwendet werden, die Sicherheit einer Mikroglia-Bezeichnung erhöhen, ist es dennoch möglich, dass es sich bei den eingeschlossenen Kernen um einen anderen myeloischen Zelltyp des Gehirns handelt. DEGs, die mithilfe von Clustern identifiziert wurden, die durch dieselben Daten definiert wurden, werden nicht unbedingt ordnungsgemäß kontrolliert59; Unser Datensatz wird es jedoch anderen ermöglichen, unsere Cluster in Zukunft zu nutzen, um dies zu mildern. Obwohl die Gesamtzahl der Mikroglia von jedem Probanden groß ist, beträgt die Gesamtzahl der untersuchten Probanden 22. Weitere Studien in größeren Kohorten sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu validieren oder vielleicht zusätzliche Einblicke in die Mikroglia-Diversität zu geben. Die Genexpression ist ein nützliches molekulares Werkzeug für die zelluläre Subtypisierung, sie beschreibt jedoch nicht immer direkt die Proteinexpression, -lokalisation oder -funktion60. Zukünftige Studien, die auf der Grundlage der hier berichteten transkriptomischen Signaturen eine Reihe von Proteinen untersuchen, werden sowohl für die Validierung als auch für die räumliche Korrelation mit pathologischen Merkmalen wertvoll sein. Die Beurteilung von Mikroglia-Phänotypen in verschiedenen Hirnregionen kann einen weiteren Kontext zum Verständnis der phänotypischen Heterogenität liefern. Eine weitere wesentliche Einschränkung ist die Verwendung von Autopsie-Gehirngewebe. Es ist möglich, dass Ereignisse kurz vor dem Tod oder postmortale Veränderungen zu den hier gemessenen Expressionsänderungen beitragen. Um die Variabilität der Gewebequalität zu verringern, haben wir nur Gewebe mit einem pH-Wert von mehr als 6,0 und einem Postmortem-Intervall (PMI) von weniger als 10 Stunden ausgewählt.

In dieser Studie identifizierten wir Mikroglia-Zustände aus isolierten postmortalen menschlichen Gehirnkernen. Unter den Kernen, die die Kriterien für eine transkriptomische Mikroglia-Signatur erfüllen, wurde in dieser Studie in allen Clustern eine „Alterungssignatur“ beobachtet23, was mit unserer Kohorte mit höherem Alter übereinstimmt. Entzündungen61 können nicht nur die Interpretation von Genexpressionsprofilen, die auf AD zurückzuführen sind, verfälschen, sondern auch zu den Krankheitsmechanismen beitragen, von denen angenommen wird, dass sie AD auslösen. Zusätzliche Studien, die Unterschiede zwischen jüngeren Kontrollpersonen und früh einsetzender Alzheimer-Krankheit untersuchen, könnten ebenfalls dazu beitragen, die Alterungs-, Entzündungs- und AD-spezifischen Signaturen zu untersuchen. Unsere Identifizierung mehrerer Internalisierungs- und Handelscluster mit unterschiedlichen metabolischen und entzündlichen Genexpressionsmustern bietet eine Plattform für weitere Studien. Das Auffinden eines AD-spezifischen Subclusters innerhalb der Population von Mikroglia, die für die homöostatische Genexpression angereichert sind, legt auch nahe, dass AD-Veränderungen und damit molekulare Signalwege, die AD vorantreiben, in Zellen identifiziert werden können, die noch nicht vollständig erforscht sind. Die Cluster-spezifischen Veränderungen in der Zusammensetzung, der Genexpression und der Genregulation im AD-Gehirn liefern zusätzliche Informationen, um die maßgeschneiderte Ausrichtung mikroglialer physiologischer Reaktionen zu unterstützen, die für die Weiterentwicklung der Therapie neurodegenerativer Erkrankungen von entscheidender Bedeutung sein werden.

Unsere Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften und wurde vom Institutional Review Board der University of Washington genehmigt. Dorsolaterales präfrontales Kortexgewebe (dlPFC) aus menschlichen Gehirnen wurde nach schriftlicher Einverständniserklärung vom Neuropathology Core des Alzheimer's Disease Research Center an der University of Washington bezogen. Bei Patienten (n = 12) wurde postmortal eine AD-Pathologie bestätigt (ADNC-Score (Alzheimer's Disease Neuropathic Change) von 2–3; Tabelle 1). Kontrollpersonen (n = 10) hatten postmortal eine geringe oder keine Neuropathologie (ADNC-Score 0–1; Tabelle 1).

Gehirnproben wurden schockgefroren und bei –80 °C gelagert. Zu den Einschlusskriterien gehörten ein PMI ≤ 10 Stunden, eine geringe komorbide Pathologie (Lewy-Körperchen und Hippocampussklerose) und ein Gehirn-pH-Wert bei der Autopsie von ≥ 6.

Kerne aus Gehirnproben wurden mithilfe von Protokollen isoliert, die an 10x Genomics Demonstrated Protocols und De Groot et al.62 angepasst waren. Kurz gesagt, vier 2-mm-Stanzen der grauen Substanz von dlPFC wurden mit einer Biopsie-Stanze (Thermo Fisher Scientific) in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis gesammelt. Alle Puffer-, Lösungs- und Medienrezepte finden Sie in den Ergänzungstabellen 1–7. Bei der Kernisolierung wurde Kernlysepuffer verwendet. Die Kern-in-Kern-Suspensionslösung wurde auf 900 µl Percoll/Myelin-Gradientenpuffer62 geschichtet. Der Gradient wurde 20 Minuten lang bei 950 g und 4 °C mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse zentrifugiert. Myelin und Überstand wurden abgesaugt, und das Kernpellet wurde in Resuspensionspuffer bei einer Konzentration von 1.000 Kernen pro Mikroliter resuspendiert und sofort mit der snRNA-Sequenz fortgefahren.

Kurz gesagt, 100–250 mg graue Substanz von dlPFC wurden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis gesammelt. Hirngewebe wurde wie oben homogenisiert. Das Homogenat wurde 10 Minuten lang bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubiert, 7 Minuten lang bei 4 °C mit 500 g pelletiert und in 900 µl Percoll/Myelin-Gradientenpuffer, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, resuspendiert. Die Suspension wurde vorsichtig mit 300 µl Kernsuspensionslösung, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, überschichtet. Der Gradient wurde 20 Minuten lang bei 950 g und 4 °C mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse zentrifugiert. Das Myelin und der Überstand wurden abgesaugt und das Kernpellet wurde sofort zu FANS weitergeleitet.

Die Kerne wurden mit kaltem FANS-Medium (10 % FBS, 10 mM HEPES, 100 μM ATA, 10 % 10× HBSS, 0,5 % Protector RNase Inhibitor, Protease- und Phosphataseinhibitoren und 1 % Saponin in nukleasefreiem Wasser) gewaschen und in FANS resuspendiert Medien mit einer Konzentration von 2–2,5 × 106 Kernen pro Milliliter. Die Kerne wurden mit 1 % Human Fc Block (Klon Fc1.3216, BD Biosciences) 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Kerne wurden entweder mit Anti-PU.1-PE (Klon 9G7, 1:50, Cell Signaling Technology) oder IgG-PE-Isotypkontrolle (Klon DA1E, 1:50, Cell Signaling Technology) für 4 Stunden auf Eis markiert, gefolgt von Drei Wäschen mit kaltem FANS-Medium und Resuspendierung in FANS-Medium, ergänzt mit 10 μg ml−1 DAPI (Sigma-Aldrich). Die Kerne wurden mit einem FACSAria III (BD Biosciences) sortiert, bis 30.000 PU.1-positive Kerne gesammelt wurden. Sortierte Kerne wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 1.000 g zentrifugiert. Das Kernpellet wurde in Resuspensionspuffer bei einer Konzentration von 1.000 Kernen pro Mikroliter resuspendiert und sofort mit der snRNA-Seq fortgefahren.

Einzelkernbibliotheken wurden mit dem Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, Library and Gel Bead Kit Version 3 (10x Genomics) gemäß dem Protokoll des Herstellers und einer Zielerfassung von 10.000 Kernen erstellt. Genexpressionsbibliotheken wurden auf der NovaSeq 6000-Plattform (Illumina) sequenziert.

Die Genzahlen wurden durch Abgleichen der Lesevorgänge mit dem hg38-Genom (GRCh38-1.2.0) mithilfe der Software CellRanger 3.0.2 (10x Genomics) ermittelt. Lesevorgänge, die der Vorläufer-mRNA zugeordnet sind, wurden einbezogen, um ungespleißte Kerntranskripte zu berücksichtigen. Der Großteil unserer Analysen wurde in R (R Development Core Team 2010) durchgeführt. Tröpfchen aus 22 nach PU.1 sortierten Proben wurden mit Seurat Version 3.3 (Lit. 63) kombiniert. Unsortierte und PU.1-sortierte Tröpfchen, die von denselben vier Probanden isoliert wurden, wurden mit Seurat kombiniert und auf die gleiche Weise analysiert. Tröpfchen mit weniger als 350 eindeutigen molekularen Identifikatoren, weniger als 350 Genen oder mehr als 1 % mitochondrialer Gene wurden von der Analyse ausgeschlossen. Umgebungs-RNA wurde mit SoupX64 aus den verbleibenden Tröpfchen entfernt. Tröpfchen mit mehreren Kernen wurden mit Scrublet65 bewertet und entfernt. Insgesamt verblieben 200.948 Kerne mit durchschnittlich 1.787 Genen pro Kern im Datensatz zur weiteren Analyse.

Die Normalisierung und Clusterung der Kerne wurde mit Seurat Version 3.3 (Lit. 63) durchgeführt. Die Daten wurden hinsichtlich der Lesetiefe normalisiert und der mitochondriale Gengehalt wurde mithilfe von Seurats SCTransform66 zurückgeführt. Die individuelle Probenvariabilität wurde mithilfe der Anker- und Integrationsfunktionen von Seurat entfernt63. Die obersten 5.000 variablen Gene wurden beibehalten. Fünfzehn Hauptkomponenten (PCs) wurden verwendet, um ein gemeinsames Diagramm der nächsten Nachbarn mit k = 20 zu erstellen. Die Modularitätsfunktion wurde mit einer Auflösung von 0,2 optimiert, um Cluster mithilfe des Louvain-Algorithmus mit mehrstufiger Verfeinerung zur Bestimmung breiter Zelltypen zu bestimmen. Jeder Cluster erfüllte einen Mindestschwellenwert von 30 definierenden DEGs und umfasste Kerne von mehr als 10 % der Kohorte (mehr als zwei Personen).

Cluster wurden anhand einer manuellen Auswertung für eine Reihe bekannter genetischer Marker67 nach Zelltyp annotiert. Es wurde ein neues Seurat-Objekt hergestellt, das nur die Mikroglia-Kerne enthielt (n = 127.371). Die Normalisierung, die Entfernung individueller Variabilität, die Integration und die Erstellung gemeinsamer Nächste-Nachbarn-Graphen wurden wie oben für die Mikroglia-Kerne wiederholt. Zwanzig PCs wurden ausgewählt, um einen erheblichen Teil der Varianz zu erklären. Cluster wurden mithilfe des Leiden-Algorithmus68 mit method=igraph undweights=true bestimmt. Die Cluster waren in allen Analysen von Louvain, Louvain mit mehrstufiger Verfeinerung und Leiden-Algorithmen hoch konserviert. Das homöostatische Cluster-Subclustering sowohl für den 22-Proben-Datensatz als auch für den APOE ε3/ε3-Alleldatensatz erfolgte nach Normalisierung, Entfernung individueller Variabilität und Integration wie zuvor und wurde unter Verwendung von 10 PCs und dem Louvain mit mehrstufigem Verfeinerungsalgorithmus durchgeführt. Die Verteilung der Kerne innerhalb jedes Clusters wurde mithilfe der Funktion „chisq.test“ in R berechnet, um den tatsächlichen Prozentsatz der Kerne aus der AD- oder Kontrollgruppe innerhalb des Clusters mit dem erwarteten Anteil der Kerne zu vergleichen, die basierend auf der Zusammensetzung des Datensatzes beitragen würden. P-Werte aus den Chi-Quadrat-Tests wurden unter Verwendung der Falscherkennungsrate (FDR) angepasst und als signifikant angesehen, wenn der angepasste P < 0,05 war.

Die differenzielle Genexpressionsanalyse der Cluster wurde mit dem MAST-Algorithmus durchgeführt. Die getesteten Gene wurden in mindestens 25 % der Kerne im Cluster exprimiert. DEGs hatten einen FDR-bereinigten P < 0,05 und eine logarithmische Faltungsänderung > 1,25. Cluster 1 wurde als inaktiviert gekennzeichnet, was in Einzelkernstudien an Mikroglia oft als „homöostatisch“ bezeichnet wird. Die Analyse der differentiellen Genexpression wurde wie oben wiederholt und die einzelnen Cluster mit Cluster 1 verglichen. GSEA wurde in ClusterProfiler69 durchgeführt, das so modifiziert wurde, dass zur Reproduzierbarkeit ein Set-Seed verwendet wurde, unter Verwendung der GO-, KEGG- und Reactome-Pathway-Sets, Version 7.2. Angereicherte Pfade hatten einen FDR-bereinigten P <0,05. Wir betrachteten Pfade als repräsentativ, wenn signifikante Ergebnisse ähnliche Gene und biologische Funktionen in mindestens zwei der drei Hauptdatenbanken (GO, KEGG und Reactome) umfassten.

Ein ergänzender Ansatz zu GSEA besteht darin, ein Clustering der Ontologie biologischer Prozesse durchzuführen, um einen umfangreicheren Satz von Begriffen zu identifizieren, die mit der Genliste verknüpft sind. Um die ELN-Cluster (3, 5 und 6) weiter zu charakterisieren, haben wir diesen Ansatz implementiert, um eine genauere Untersuchung des biologisch verbundenen Prozesses zu erhalten, der von jedem Cluster angetrieben wird. Zur Durchführung dieser Analyse verwendeten wir verschiedene Ansätze und entschieden uns letztendlich für die Cytoscape-Netzwerk-Clustering-Anwendung ClueGO70,71, die in den letzten Jahren häufig für diesen Zweck eingesetzt wurde72,73,74,75. Dadurch entsteht ein Netzwerk genetisch verknüpfter Prozesse, das über einen einzelnen GO-Term-Treffer hinausgeht und größere Sicherheit dafür schafft, dass ein grundlegender biologischer Prozess auf der Grundlage der unterschiedlichen Expression eines bestimmten Satzes von Genen beeinflusst wird. Die Cluster 3, 5 und 6 wurden jeweils unabhängig voneinander zur Analyse unter Verwendung eines einseitigen positiven Anreicherungsalgorithmus eingereicht, der hypergeometrische Tests mit einem Kappa-Schwellenwert von 0,4 verwendet, um die biologischen Prozessverbindungen zu optimieren. Jeder in das Netzwerk aufgenommene Term wurde zunächst nach einem Schwellenwert für mehrere Testkorrekturen von P < 0,05 gefiltert und hierarchisch nach Termen mit einem Benjamini-Hochberg-Korrekturwert von P < 0,01 gewichtet. Da dieses Verfahren zur Validierung und Visualisierung durchgeführt wird, haben wir Netzwerke mit Begriffen mit niedrigerem Rang gekürzt, um eine einfachere Visualisierung zu ermöglichen.

Die Trajektorienanalyse wurde mit Monocle3 (Ref. 45) an mehreren Permutationen unseres heruntergerechneten Datensatzes durchgeführt. Die Daten wurden auf 1.000, 2.000, 3.000 oder 5.000 Kerne pro Cluster heruntergerechnet und in ein Zelldatensatzobjekt übertragen, und Monocle3 „learn_graph“ wurde ausgeführt. Hauptkomponentenanalyse und UMAP-Einbettungen (Uniform Manifold Approximation and Projection) wurden aus dem Seurat-Objekt extrahiert. Wir haben den Algorithmus sowohl mit als auch ohne definierten Startpunkt angewendet. Die 5.000 heruntergesampelten Kerne pro Cluster begannen, die Fähigkeit von Monocle, eine konsistente Flugbahn zu bilden, zu zerstören, während die 1.000, 2.000 und 3.000 Mehrfachpermutationen konsistent etwas Ähnliches wie das repräsentative Bild in Abb. 5 (3.000 Kerne pro Cluster) bildeten. .

Regulons wurden mithilfe des SCENIC-Workflows in Python (pySCENIC)76,77 abgeleitet. Wir haben zufällig 2.000, 3.000 oder 5.000 Kerne in jedem Cluster ausgewählt (oder, wenn sie weniger als diese Zahl haben, alle Kerne im Cluster), um die Rechenzeit zu verkürzen und eine proportionale Darstellung aller Cluster zu erhalten. Wir erstellten fünf Teilmengen jeder Kombination und wiederholten die Analyse zweimal für jede Teilmenge, um die Konsistenz der Regulons in der Analyse zu beurteilen. Zunächst verwendeten wir normalisierte Zählungen mit hochvariablen Genen, um die koexprimierenden regulatorischen Netzwerkmodule mithilfe des maschinellen Lernalgorithmus GRNBoost2 mit der Funktion „grn“ und Standardeinstellungen zu generieren76. Zweitens wurden die Module mithilfe der Funktion „-ctx“ gefiltert, die eine cis-regulatorische Motivanalyse (RcisTarget) verwendet, um nur Module anzureichern, die für mutmaßliche Zielgene des Transkriptionsfaktors angereichert sind. Regulons werden durch die Kombination mehrerer Module für einen einzelnen Transkriptionsfaktor identifiziert. Drittens wurde die AUCell-Funktion verwendet, um die Regulonaktivität für jeden Kern zu berechnen. Für jedes Regulon in jedem Cluster wurden Regulon-Spezifitätswerte berechnet. Ranking-Spezifitätswerte identifizierten die zehn besten Regulons für einen bestimmten Cluster für eine bestimmte Teilmenge des Datensatzes und die Konsistenz der Ergebnisse über Teilmengen hinweg.

Präparierte Gewebe aus dem dlPFC der 22 Fälle in der Kohorte wurden mit Paraformaldehyd und eingebettetem Paraffin fixiert. Die Proben wurden bei 15 µm geschnitten und vor der Immunfärbung entparaffiniert. Die Objektträger wurden 20 Minuten lang in Citratpuffer (Sigma-Aldrich, C9999) gekocht und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (10 % Eselserum, 0,1 % Trition X-100 und 0,05 % Tween 20 in TBS) überführt. Die Objektträger wurden in primären Antikörpern inkubiert (Anti-LAMP1 1:100, Invitrogen, 14-1079-80; Anti-Iba-1 1:250, Abcam, ab5076; Anti-dsDNA 1:250, Millipore, MAB1293; Anti-PTGDS/ PGD2 1:100, R&D Systems, MAB10099; Anti-P2RX7 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-514962; Anti-P2RY12 1:50, Alomone, APR-012; und Anti-PDE4B 1:50, LSBio, LS- C173292-100) über Nacht bei 4 °C. Die Objektträger wurden dreimal 5 Minuten lang in TBS-T gespült, bevor der sekundäre Antikörper (Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 488 Esel-Anti-Ziege, A11055; Thermo Fisher Scientific, Alexa Fluor 555 Esel-Anti-Maus, A31570; Alexa Fluor 555 Esel-Anti-Maus) Kaninchen 555, A31572; Alexa Fluor 647 Esel Anti-Maus, A31571; oder Alexa Fluor 647 Esel Anti-Kaninchen, A32795) Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Objektträger 5 Minuten lang mit DAPI (1:1.000, Millipore, D8417) gefärbt, gefolgt von drei 5-minütigen TBS-T-Waschvorgängen. True Black (Thermo Fisher Scientific, NC1125051), 1:20 in 70 % Ethanol verdünnt, wurde 50 Sekunden lang auf die Objektträger gegeben, gefolgt von zwei weiteren 5-minütigen Waschgängen in TBS, bevor sie mit Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100-01) fixiert wurden ). Die Objektträger wurden entweder mit einem konfokalen Olympus FluoView-1000-Mikroskop oder einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop (Nikon A1R mit Yokogawa W1 Spinning-Disk-Kopf) mit Ölobjektiven ×40 und ×100 abgebildet und die maximale Projektion von Z-Stapelbildern erzeugt. Die Bilder wurden mit Fiji entfleckt.

Zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen wurden keine statistischen Methoden verwendet, aber unsere Stichprobengrößen ähneln denen in früheren Veröffentlichungen22,25,26. Die Datenerfassung und -analyse erfolgte nicht unabhängig von den Versuchsbedingungen. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Der wichtigste snRNA-seq-Datensatz der PU.1-Anreicherung aus dlPFC stammt von 22 Menschen (12 AD- und 10 gesunde Spender), alle im Alter von > 60 Jahren. Da die Proben von Menschen stammten und die Studie darauf ausgelegt war, Unterschiede zwischen AD-Fällen und Gehirnen im gesunden Alter festzustellen, wurden die Proben nicht zwischen verschiedenen Erkrankungen randomisiert. Wir haben die Sequenzierungschargen nach Geschlecht und Krankheitsstatus ausgeglichen, sodass in jeder Sequenzierungscharge alle Erkrankungen vorhanden waren. Die statistische Analyse für Pseudobulk-RNA-seq-Daten und snRNA-seq-Daten verwendete DESeq2 bzw. MAST. DESeq2 ist darauf ausgelegt, die RNA-seq-Zähldaten durch eine negative Binomialverteilung zu modellieren, und MAST ist darauf ausgelegt, die in snRNA-seq-Daten beobachtete Nullinflation zu modellieren. Für die statistische Analyse des Clusteranteils wurden Zähldaten verwendet, die nicht auf einer Normalverteilung beruhen. Beim Downsampling des Datensatzes für die Trajektorienanalyse und den Regulon-Nachweis wurden die Kerne nach dem Zufallsprinzip heruntersampelt, um mehrere Iterationen des Datensatzes zu generieren, die die Cluster gleichmäßig darstellten und die Proben in ihren ursprünglichen Proportionen behielten. Für die Trajektorienanalyse wurden drei Downsampling-Permutationen mit drei Downsampling-Auflösungen (1.000, 2.000 oder 3.000 Kerne pro Cluster) für insgesamt neun Iterationen analysiert, was zu ähnlichen Ergebnissen wie in Abb. 4 führte. Für die pySCENIC-Regulon-Erkennung war der Datensatz Downsampling mit fünf Permutationen bei 1.000 Kernen pro Cluster und drei Permutationen bei 2.000 und 3.000 Kernen pro Cluster. Jede dieser Permutationen wurde mehrmals durch die pySCENIC-Pipeline ausgeführt, was zu 27 Regulon-Erkennungsinstanzen führte. Diese 27 Fälle wurden zu den in Abb. 3 und den erweiterten Daten in Abb. 6 dargestellten Konsistenzbewertungen zusammengefasst. Experimente zur Immunhistochemie von menschlichem Gewebe wurden an mindestens Proben von fünf Menschen wiederholt, und die angezeigten Bilder sind repräsentativ für die in mehreren Feldern beobachtete Färbung von mindestens drei menschlichen Proben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Der gesamte anonyme Datensatz, der für diese Ressource in seiner rohen und mit Seurat-Objekten verarbeiteten Form generiert wurde, ist über Synapse verfügbar (https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51272688). Die Daten stehen unter kontrollierten Nutzungsbedingungen zur Verfügung, die durch die Datenschutzbestimmungen festgelegt sind. Für den Zugriff auf die Daten ist eine Datennutzungsvereinbarung erforderlich. Diese Registrierung erfolgt ausschließlich zur Wahrung der Anonymität der Studienteilnehmer. Alle weiteren Studiendaten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Diese Ressource verwendete auch das öffentlich verfügbare menschliche hg38-Genom (GRCh38-1.2.0).

Die zur Generierung unserer Analysen verwendeten Skripte sind unter https://github.com/keprater/jayadevlab_pu.1_project verfügbar. Der zum Ausführen der Skripte erforderliche Container mit denselben Seurat- und anderen Paketversionen, die im Code verwendet werden, steht zum Download unter https://hub.docker.com/r/keprater/jayadevlab/tags oder im Synapse-Projekt mit dem zur Verfügung Datensatz. Verwenden Sie Container-Tag 6.3, um unsere Analysen mit denselben Paketversionen zu replizieren.

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Die Finanzierung dieser Studien erfolgte durch RF1AG063540 (SJ und GAG), P30AG066509 (SJ, KEP, JEY und CDK), R01AG073918 (SJ und JEY) und den Weill Neurohub (SJ und CDK). Zusätzliche Unterstützung kam von der Ellison Foundation (SJ). KEP wurde vom National Institute on Aging 5T32-AG052354-02 unterstützt. Die in dieser Studie verwendeten Autopsiematerialien wurden vom University of Washington Neuropathology Core bezogen, das vom Alzheimer’s Disease Research Center (P50AG005136-33) und der Adult Changes in Thought Study (U01AG006781) unterstützt wird. Diese Arbeit wurde durch die Nutzung der fortschrittlichen Rechen-, Speicher- und Netzwerkinfrastruktur erleichtert, die vom Supercomputersystem Hyak an der University of Washington bereitgestellt wird.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Katherine E. Prater, Kevin J. Green.

Abteilung für Neurologie, University of Washington, Seattle, WA, USA

Katherine E. Prater, Kevin J. Green, Sainath Mamde, Alexandra Cochoit, Carole L. Smith und Suman Jayadev

Biostatistikprogramm, Abteilung für öffentliche Gesundheitswissenschaften, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA

Wei Sun

Zentrum für Evolution und Medizin, Arizona State University, Tempe, AZ, USA

Kenneth L. Chiou und Noah Snyder-Mackler

School of Life Sciences, Zentrum für Evolution und Medizin, Arizona State University, Tempe, AZ, USA

Kenneth L. Chiou und Noah Snyder-Mackler

Sage Bionetworks, Seattle, WA, USA

Laura Heath, Jesse Wiley und Benjamin Logsdon

Abteilung für Labormedizin und Pathologie, University of Washington, Seattle, WA, USA

Shannon E. Rose, C. Dirk Keene und Jessica E. Young

Institut für Stammzellen- und Regenerative Medizin, University of Washington, Seattle, WA, USA

Ronald Y. Kwon, Jessica E. Young und Suman Jayadev

Abteilung für Orthopädie und Sportmedizin, University of Washington, Seattle, WA, USA

Ronald Y. Kwon

ASU-Banner Neurodegenerative Disease Research Center, Arizona State University, Tempe, AZ, USA

Noah Snyder-Mackler

Abteilung für medizinische Genetik, University of Washington, Seattle, WA, USA

Elizabeth E. Blue & Suman Jayadev

Brotman Baty Institute for Precision Medicine, Seattle, WA, USA

Elizabeth E. Blue

Cajal Neuroscience, Seattle, WA, USA

Benjamin Logsdon

Abteilung für Biostatistik, University of Washington, Seattle, WA, USA

Ali Shojaie

Abteilung für Neurologie, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA

Gwenn A. Garten

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Konzipierte und entworfene Experimente: SJ, KJG, KEP, JEY, CLS, BL und GAG. Durchführung der Experimente: KJG, CLS, AC, SR und CDK. Analysierte Daten: KEP, KJG, SM, AC, KLC und JW. Aufsicht über Biostatistik: WS und AS Verfasste das Papier: KEP, KJG, SJ, SM und AC. Bearbeitete das Papier: CLS, WS, AS, JY, EEB und GAG. Bereitgestellter Code: WS, SM, KLC, NS-M., RYK und LH. Konzipierte die Forschung und Kooperationen: SJ, GAG, JEY, EEB und BL

Korrespondenz mit Suman Jayadev.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Aging dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(A) Fluoreszenzaktiviertes Kernsortierungsdiagramm von Kernen, die aus der grauen Substanz des dorsolateralen präfrontalen Kortex von postmortalem menschlichem Hirngewebe isoliert wurden, zeigt eine DAPI-positive Population, aus der spätere Populationen gezogen werden. (B) Isotyp- und PU.1-Färbungsbeispiele, die die PU.1-positive Population veranschaulichen. (C) Unsortierte snRNAseq-Daten aus vier Proben zeigen mehrere Gehirnzelltypen und eine kleine Population von Mikroglia (n = 1032 Zellen), die weiter in fünf Cluster unterteilt werden können. (D) Nach der PU.1-Anreicherung enthält ein snRNAseq-Datensatz derselben vier Individuen eine größere Anzahl von Mikroglia (n = 23.310 Zellen), und diese Mikroglia können weiter in neun Cluster unterschieden werden.

Die Mikroglia-Markergene CX3CR1, C1Qb, SPI1 (PU.1) und APOE zeigen alle eine höhere Expression in den 10 Mikroglia-Subclustern (links mit 1–10 nummeriert) als in anderen Zelltyp-Clustern (rechts nach Zelltyp gekennzeichnet). .

(A) Die Astrozyten-Markergene GFAP und S100B zeigen eine höhere Expression in den beiden Subclustern Astrocytes-1 und Astrocytes-2 als in den 10 definierten Mikroglia-Subclustern. Während der Mikroglia-Cluster 6 eine Expression von GFAP aufweist, weist er keine Expression von S100B auf. (B) Die peripheren Monozytenmarker CCL5 weisen in unserem Datensatz eine geringe Expression auf, werden jedoch am stärksten vom CD163+-Cluster exprimiert, der nicht in unserem Mikroglia-Datensatz enthalten war.

Die in den Clustern 3, 5 und 6 unterschiedlich exprimierten Gene wurden verwendet, um mithilfe der Cytoscape-Anwendung ClueGO eine netzwerkbasierte Anreicherung der Genontologie voranzutreiben. Dieser Ansatz verwendet einen einseitigen positiven Anreicherungsalgorithmus, der hypergeometrische Tests mit einem Kappa-Schwellenwert von 0,4 verwendet, um die biologischen Prozessverbindungen zu optimieren. Jeder in das Netzwerk aufgenommene Term wurde zunächst nach einem Schwellenwert für mehrere Testkorrekturen von p < 0,05 gefiltert und hierarchisch nach Termen mit einem Benjamini-Hochberg-Korrekturwert von p < 0,01 gewichtet. Die Knoten werden innerhalb jedes Netzwerks basierend auf zwei Faktoren dargestellt: Anzahl der Gene (Größe des Kreises) und statistische Signifikanz (hellrot = Benjamini-Hochberg-korrigierter p < 0,05; dunkelbraun = Benjamini-Hochberg-korrigierter p < 0,0005). (A) In Cluster 3 wurden drei kleine Subcluster identifiziert, die mit Endozytose, rezeptorvermittelter Endozytose sowie Lipidbindung und -synthese assoziiert sind (ganz links); ein zweiter Untercluster konzentriert sich auf die synaptische Endozytose (mittlere Gruppe); und ein dritter betrifft den Vesikeltransport (ganz rechts). (B) In Cluster 5 wurde ein Subcluster von Begriffen identifiziert, die Autophagie, rezeptorvermittelte Autophagie und die Regulierung dieser beiden Begriffe umfassen (ganz links); Ein zweiter größerer Cluster identifiziert Endozytose und rezeptorvermittelte Endozytose, Prozesse, die mit der autophagischen Regulation sowie dem vesikulären Transport verbunden sind. (C) In Cluster 6 wurden drei Subnetzwerke im ELN-Raum identifiziert, die eine aktive Endozytose, lysosomale Prozesse und einen Transfer zwischen diesen Kompartimenten und dem Trans-Golgi-Netzwerk (links) demonstrieren. Eine zweite große Gruppe von Begriffen wurde im Zusammenhang mit der Funktion, Aktivierung und Regulation des angeborenen Immunsystems sowie damit verbundenen Entzündungsprozessen identifiziert (rechte Seite).

(A) UMAP der unvoreingenommenen Clusterbildung an 13 Proben von nur APOE ε3/ε3-Individuen zeigt 9 Cluster. (B) Ähnlich wie die im gemischten APOE-Genotyp-Datensatz identifizierten Cluster unterscheiden sich die im APOE ε3/ε3-Genotyp-Datensatz identifizierten Cluster durch Genexpression. Für jeden Cluster werden die Top-5-Gene angezeigt. (C) Venn-Diagramme, die eine Überlappung zwischen Clustern aus den gemischten APOE- und APOE ε3/ε3-Kohorten zeigen und eine signifikante Überlappung in den Genexpressionsprofilen zeigen.

Dies sind die Transkriptionsfaktoren, die am häufigsten die Genexpression in den Clustern 4, 7, 9 und 10 steuerten. Die Werte geben den Prozentsatz der Replikate von Permutationen des Datensatzes an, bei denen dieser Transkriptionsfaktor für den jeweiligen Cluster eindeutig war, wobei eine dunklere Farbe höhere Prozentsätze anzeigt . Beachten Sie, dass zwar einige ähnliche Transkriptionsfaktoren in mehreren Clustern vorkommen, insbesondere die am weitesten verbreiteten Transkriptionsfaktoren jedoch einzigartig sind und repräsentativ für die Genexpression sind, die biologische Funktionen in diesen Clustern steuert.

Ähnlich wie beim größeren Datensatz sind die Transkriptionsfaktoren, die die Genexpression innerhalb von Clustern steuern, unterschiedlich, wenn die Daten nur aus APOE ε3/ε3-Allelträgern bestehen.

Heatmaps von: (A) dem Gene Ontology (GO)-Satz endolysosomaler Gene zeigen eine signifikante Hochregulierung in Cluster 6. (B) Der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Satz von Toll-Like-Receptor (TLR)-Genen zeigt eine signifikante Hochregulierung in Cluster 8, wie angesichts des klassischen entzündlichen Phänotyps, der in der Genexpression beobachtet wird, zu erwarten wäre. (C) Die „Disease Associated Microglia“ (DAM)-Genliste von Keren-Shaul et al. 2017 zeigt eine Hochregulierung von Genen über mehrere Cluster hinweg in unserem menschlichen Datensatz. Dies entspricht anderen Humanstudien, bei denen im Gegensatz zu Studien mit Mausmodellen der Alzheimer-Krankheit kein einziger DAM-Cluster identifiziert wurde.

(A) Ein repräsentatives Beispiel einer Färbung, die in mehreren Feldern bei mindestens drei Menschen beobachtet wurde, zeigt eine aktivierte Mikroglia mit sowohl einer großen Anzahl von Lysosomen (Lampe-1, weiß) als auch zytosolischer dsDNA (magenta) in einem AD-Fall (gefüllte Pfeilspitze). (B) Mikroglia (spitze Pfeilspitze) ohne zytosolische dsDNA-Immunreaktivität (Magenta) im gleichen Fall und Gewebeabschnitt erscheinen verzweigt mit weniger Lamp-1-Signal. Alle Maßstabsbalken repräsentieren 15 Mikrometer.

(A) Die Ergebnisse des vollständigen Datensatzes wurden in der reinen APOE-ε3/ε3-Allel-Kohorte repliziert, was darauf hindeutet, dass innerhalb des „homöostatischen“ Clusters mehrere Subpopulationen existieren. Diese Subpopulationen unterscheiden sich durch ihre Genexpression, obwohl sie aus einer „homöostatischen“ Subpopulation bestehen. (B) Innerhalb des „homöostatischen“ Clusters 1 der APOE ε3/ε3-Kohorte gibt es einen Cluster 1,5, der im AD-Gehirn signifikant erhöht ist, wie wir es in der gesamten Kohorte gefunden haben (Abb. 6; Chi-Quadrat-FDR korrigiert p = 6,7673 × 10). −6). **= p < 0,01.

Ergänzungstabellen 1–7.

Ergänzende Daten für den gemischten APOE-Genotyp-Datensatz mit 22 Proben, einschließlich DEGs im Vergleich zu allen anderen Clustern und im Vergleich zum HM-Cluster, Pfaden für jeden Cluster, die durch GSEA identifiziert wurden, und Pseudobulk-Ergebnissen, die AD mit Kontrollfällen innerhalb jedes Clusters vergleichen.

Ergänzende Daten für den APOE ε3/ε3-Datensatz mit 13 Proben, einschließlich DEGs im Vergleich zu allen anderen Clustern und im Vergleich zum HM-Cluster, von GSEA identifizierte Pfade für jeden Cluster, Prozentsatz der Überlappung von DEGs mit den gemischten APOE-Genotyp-Datensatzclustern mit 22 Proben und Pseudobulk-Ergebnisse, die AD mit Kontrollfällen innerhalb jedes Clusters vergleichen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Prater, KE, Green, KJ, Mamde, S. et al. Menschliche Mikroglia zeigen einzigartige Transkriptionsveränderungen bei der Alzheimer-Krankheit. Nat Aging (2023). https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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Eingegangen: 07. Juli 2022

Angenommen: 25. April 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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